SPHINGOMONAS S6 SP. NOV. ПОТЕНЦИАЛЬНО БЕЗОПАСНЫЙ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ШТАММ-КАНДИДАТ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА ДЕРЕВЬЕВ ТОПОЛЯ БЕЛОГО
SPHINGOMONAS S6 SP. NOV. ПОТЕНЦИАЛЬНО БЕЗОПАСНЫЙ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ШТАММ-КАНДИДАТ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА ДЕРЕВЬЕВ ТОПОЛЯ БЕЛОГО
Аннотация
Белый тополь (Populus alba L.) часто используется в озеленении городов и заготовки древесины. Эндофитные бактерии, живущие в корнях дикого тополя P. alba, потенциально могут стимулировать рост деревьев, обеспечивая поглощение минеральных элементов из почвы и синтезируя полезные органические вещества. Одним из ключевых условий возможного использования бактериальных штаммов в биотехнологии является безопасность для человека и окружающей среды. В настоящей работе в геноме нового штамма эндофитной бактерии Sphingomonas sp. S6, выделенного из корней P. alba, нами выполнен поиск генов, которые могут стимулировать рост тополя, а также генов, которые могут быть потенциально опасны для человека и гены устойчивости к антибиотикам. В результате обнаружены гены, отвечающие за биосинтез зеаксантина. Факторов вирулентности, например, генов, кодирующих токсины, не обнаружено. Не обнаружено также и специальных генов устойчивости к антибиотикам. Полученные нами результаты указывают на то, что Sphingomonas sp. S6, может быть кандидатным штаммом для стимуляции роста белого тополя.
1. Введение
Тополь отличается от других древесных растений высокой скоростью роста и накопления биомассы . Это важно при озеленении крупных населенных пунктов, т.к. тополя поглощают больше углекислого газа и выделяют больше кислорода по сравнению с другими деревьями и, тем самым, эффективнее улучшают состав атмосферы. Кроме того, корневые системы тополей, особенно P. alba способны накапливать тяжелые металлы (кадмий, свинец, медь, цинк и др.), а также ртуть , , что позволяет использовать их для целей фиторемедиации почвы. Фиторемедиация – это область экобиотехнологии, в которой растения используют для очищения воздуха, воды и почвы от тяжелых металлов и других загрязнителей .
Известно, что микроорганизмы, сосуществующие с растениями, могут повышать их устойчивость к стрессу и усиливать их защитные реакции , . Тополь имеет разветвленную корневую систему, которая обеспечивает большую площадь поверхности для контакта с почвой и средой обитания. Кроме того, корни содержат много питательных веществ, таких как сахара, аминокислоты, углеводы, и поэтому являются идеальными местами прикрепления для различных микроорганизмов . Корни тополя содержат эндофитные грибы, бактерии и археи, которые живут в тканях растения. Эндофиты корней играют важную роль в жизни деревьев. Они улучшают усвоение питательных веществ и поглощение необходимых минералов из почвы. Симбиотические микроорганизмы часто обладают свойствами, стимулирующими рост растений, в том числе и благодаря секреции соответствующих гормонов , , , .
В представленной работе в геноме выделенного нами из корней P. alba нового штамма бактерии-эндофита Sphingomonas sp. S6 выполнен биоинформатический анализ генов, чьи продукты могут стимулировать рост растений, а также тех, которые могут быть потенциально опасны для человека.
2. Методы и принципы исследования
Источником для поиска генов и кластеров стали собственные данные полногеномного секвенирования штамма Sphingomonas sp. S6, который был впервые выделен и культивирован нашим коллективом.
Выделение тотальной ДНК из бактерий проводили с помощью набора DNeasy PowerSoil Pro DNeasy (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендованным производителем протоколом. Количественное определение ДНК проводили с помощью флуорометра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, USA). Для создания библиотек двухцепочечной ДНК использовали набор NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, USA). Секвенирование проводили с использованием набора MiSeq Reagent Kit v3 (600 циклов) на приборе Illumina MiSeq (Illumina, США).
Аннотацию генома Sphingomonas sp. S6 проводили с помощью DFAST и Prokka. Результаты поиска целевых групп генов верифицировали с помощью InterPro и BLAST . Для предсказания биосинтетических кластеров вторичных метаболитов использовали бактериальная версия веб-инструмента antiSMASH . В поиске генов, отвечающих за антибиотикорезистентность и патогенность использовали программу BV-BRC Integrated Genome Analysis pipeline, доступную на сервере BV-BRC . Кроме того, полученные данные дополняли результатами поисков, проведенных в различных базах данных, таких как CARD RGI , PATRIC , DrugBank , TTD , TCDB , VFDB , и Victors .
3. Результаты и обсуждение
3.1. Кластеры биосинтеза вторичных метаболитов в геноме S6
Вторичные метаболиты необходимы бактериям для получения питательных веществ из почвы (например, сидерофоры для поглощения железа), взаимодействия с другими бактериями (например, через антагонистическое действие антибиотиков, контроль численности популяции с помощью кворум-сенсинга, установление мутуалистических отношений) и растениями (в случае эндофитов), сопротивления различным стрессам и так далее , . Мы использовали бактериальную версию antiSMASH для предсказания кластеров биосинтеза вторичных метаболитов в геноме Sphingomonas sp. S6. Основные результаты этого анализа представлены в Таблице 1.
Таблица 1 - Кластеры генов биосинтеза вторичных метаболитов, обнаруженные в геноме Sphingomonas sp. S6
Контиг | Координаты | Тип | Наиболее похожий известный кластер | Сходство |
3.1 | 274655-299881 | Терпены | Зеаксантин (Xanthobacter autotrophicus Py2) | 100% |
Согласно литературным данным, мы рассматриваем только кластеры со сходством не менее 60%. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что Sphingomonas sp. S6 содержит кластер для биосинтеза зеаксантина.
Колонии Sphingomonas sp. S6 имеют бледно-желтый цвет, что косвенно подтверждает наличие кластера генов для биосинтеза зеаксантина. Представители рода Sphingomonas известны как продуценты каротиноидов, в том числе зеаксантина. Например, S. jaspsi была описана как бактерия, продуцирующая зеаксантин и ностоксантин , морская бактерия Sphingomonas sp. SG73 продуцирует ностоксантин , а астаксантин дирамнозид был впервые выделен из S. astaxanthinifaciens . Каротиноиды необходимы растениям для выполнения целого ряда функций, связанных с реакцией на окислительный стресс, фотосинтезом, фотозащитой, пигментацией, синтезом фитогормонов и сигнализацией .
Биосинтез каротиноидов способствует стимулированию роста растений у Sphingomonas sp. S6. В целом геномы рода Sphingomonas очень разнообразны, и представители с признаками, способствующими росту растений, включая устойчивость к металлам, встречаются на разных ветвях эволюционного древа рода . Гены, стимулирующие рост растений, были обнаружены даже в штаммах Sphingomonas, выделенных на Международной космической станции . Возможно, что гены, стимулирующие рост растений, также важны для жизнеспособности и стрессоустойчивости самих видов Sphinomonas.
Кроме того, есть примеры успешного совместного культивирования эндофитных бактерий с генетически далекими растениями: например, S. nostoxanthinifaciens, продуцент ностоксантина, первоначально выделенный из листьев Abies koreana, помог семенам Arabidopsis thaliana бороться со стрессом, нейтрализуя реактивные виды кислорода . Для определения способности новых эндофитных бактерий стимулировать рост растений необходимы дальнейшие исследования, в том числе совместное культивирование с тополем белым и другими тополями.
3.2. Гены патогенности для человека и устойчивости к антибиотикам
Потенциальное применение новых штаммов в биотехнологии растений ставит вопрос об их безопасности для человека. Чтобы ответить на этот вопрос, в геноме штамма Sphingomonas sp. S6 провели поиск генов, связанных с патогенностью для человека и устойчивостью к антибиотикам. Общие результаты обобщены в Табл. 2.
Таблица 2 - Количество генов, имеющих медицинское значение, в геноме штамма S6
Категория | Факторы вирулентности | Устойчивость к антибиотикам | Транспортеры | Устойчивость к лекарствам | |||
База данных | VFDB | Victors | PATRIC_VF | PATRIC | CARD RGI | TCDB | DrugBank |
- | 1 | 2 | - | 32 | 1 | 4 | 1 |
В геноме Sphingomonas sp. S6, по-видимому, отсутствуют гены, кодирующие токсины.
Хотя количество совпадений относительно велико, большинство из них представляют собой обычные метаболические ферменты и транспортеры. Например, гены, кодирующие ацилтрансферазный белок AcpXL, шаперонный белок DnaK и L-карнитиндегидратазу/индуцибельный белок F CaiB, были идентифицированы как «факторы вирулентности» у Sphingomonas sp. S6 благодаря их гомологии с белками Brucella spp.
Что касается категории устойчивости к антибиотикам, то Sphingomonas sp. S6 обладает генами эффлюксных насосов EmrAB-TolC и MexJK-OprM/OpmH, порина внешней мембраны OprB и OxyR, который является транскрипционным активатором, регулирующим реакцию на окислительный стресс , , . В целом, в ходе поиска были обнаружены факторы транскрипции и трансляции, рибосомальные белки и ферменты, такие как аланин-рацемаза, которые обычно кодируются в геномах многих видов бактерий. Таким образом, геном штамма S6 не содержит специфических генов, кодирующих патогенные для человека факторы и специфические гены устойчивости к антибиотикам.
Последний аспект, который мы хотели бы обсудить — это потенциальная патогенность наших штаммов для человека. Некоторые виды рода Sphingomonas признаны патогенными. Описаны случаи бактериемии, вызванной S. paucimobilis и S. koreensis, включая нозокомиальные инфекции , , . Это согласуется с наличием в их геномах генов вирулентности и устойчивости к антибиотикам. Однако геном штамма S6 не содержит специфических патогенных генов или генов устойчивости к антибиотикам. Поэтому мы считаем, что наши штаммы не представляют опасности для здоровых людей.
4. Заключение
Согласно имеющимся результатам, мы считаем данный штамм перспективным для совместного культивирования с белым тополем. С высокой долей вероятности он синтезирует зеаксантин, который при выделении в корни растения будет оказывать положительные эффекты на рост растения. Мы не наблюдаем признаков того, что Sphingomonas sp. S6 может быть патогенным для человека, тем не менее для того, чтобы однозначно убедиться в его безопасности для человека, необходимо провести дополнительные эксперименты.