Влияние мутации SDHB: p.M103V на структуру и динамику белка
Влияние мутации SDHB: p.M103V на структуру и динамику белка
Аннотация
Параганглиомы головы и шеи – это редкие нейроэндокринные опухоли, характеризующиеся высокой степенью наследуемости (около 40%) и часто ассоциированные с мутациями в генах SDHx. Вагальная параганглиома (ВПГ) развивается из параганглия, располагающегося вдоль блуждающего нерва, и встречается в 13% случаев параганглиом головы и шеи. Среди всех параганглиом/феохромоцитом, ВПГ является наиболее агрессивной опухолью и чаще всего метастазирует, при этом из-за редкости заболевания, генетика ВПГ мало изучена. Ранее мы идентифицировали миссенс вариант p.M103V в гене SDHB с неопределенной клинической значимостью в исследуемой выборке из 36 ВПГ. В данной работе выполнен анализ влияния выявленной мутации SDHB: p.M103V на структуру и динамику белка с использованием метода моделирования молекулярной динамики. Показано, что эта мутация вызывает серьезные структурные изменения и может привести к нарушению стабильности белка и его функции. Таким образом, негативный эффект варианта p.M103V на структуру/функцию субъединицы SDHB, а также ассоциация с параганглиомами/феохромоцитомами и другими опухолевыми синдромами, свидетельствуют о ее вероятной патогенности.
1. Введение
Параганглиомы и феохромоцитомы являются опухолями параганглиев – органов вегетативной нервной системы. Параганглии разделяют на хромаффинные, относящиеся к адреналовой системе и способные к секреции, и нехромаффинные, выполняющие функцию хеморецепторов. Феохромоцитомы развиваются из наиболее крупного симпатического параганглия – мозгового вещества надпочечников. Парасимпатические параганглиомы преимущественно формируются в области головы и шеи; в зависимости от места локализации выделяют каротидные, вагальные и параганглиомы среднего уха. Вагальные параганглиомы (ВПГ) являются наиболее редкими и мало изученными, эти опухоли составляют 13% от всех параганглиом головы и шеи . ВПГ характеризуются самым высоким метастатическим потенциалом (16-19%) среди всех параганглиом/феохромоцитом . Мультифокальные формы ВПГ, которые часто образуются совместно с каротидными параганглиомами и располагаются с одной или с обеих сторон шеи, могут возникать в 30-40% случаев при семейных формах опухолей . На протяжении многих десятилетий хирургическое удаление параганглиом головы и шеи является основным методом лечения, которое сопряжено с серьезными послеоперационными осложнениями . В случае неоперабельных или метастазирующих опухолей также применяют лучевую и химиотерапию, однако эти методы имеют низкую эффективность . На сегодняшний день крайне актуальными являются вопросы, касающиеся молекулярной основы развития параганглиом головы и шеи, поиска новых эффективных диагностических и прогностических биомаркеров и мишеней для терапии.
Важной особенностью параганглиом/феохромоцитом является их высокая степень наследуемости по сравнению с другими злокачественными новообразованиями человека. Около 40% этих опухолей ассоциированы с наследственными мутациями как минимум в одном из 15 известных генов предрасположенности . Примерно в 30% случаев опухоли с такими мутациями возникают как проявление наследственных опухолевых синдромов. Параганглиомы головы и шеи чаще всего связаны с мутациями в генах SDHх (SDHA, SDHB, SDHC и SDHD), кодирующих соответствующие субъединицы сукцинатдегидрогеназы (SDH) . Наличие мутаций в этих генах может приводить к состоянию псевдогипоксии и гиперметилирования, а также связано с более агрессивным поведением опухоли (мультифокальный рост, рецидив и метастазирование) . Выявление патогенных/вероятно патогенных мутаций в генах SDHx имеет высокую диагностическую и прогностическую значимость для ведения пациентов с параганглиомами/феохромоцитомами.
В данном исследовании, нами проведено моделирование молекулярной динамики варианта p.M103V в гене SDHB, идентифицированного у пациента с ВПГ. На сегодняшний день, клиническая значимость варианта SDHB: p.M103V является неопределенной. Результаты анализа влияния p.M103V на структуру и динамику субъединицы SDHB в комплексе сукцинатдегидрогеназы могут помочь в определения патогенности этой мутации.
2. Методы и принципы исследования
2.1. Создание гомологичной модели
Гомологичная модель субъединицы SDHB создана из известной аминокислотной последовательности белка с помощью пакета программ Modeller . В качестве референса использовалась структура сукцинатдегидрогеназы свиньи PDB ID:1ZOY (разрешение 2,4 Å). Гомологичные структуры белка дикого типа и белка с исследуемой мутацией SDHB: NM_003000: c.A307G, p.M103V (chr1: 17355211, rs140178341) сконструированы на основе выравнивания двух аминокислотных последовательностей белков человека, а также PDB структуры референсной 3D модели.
2.2. Создание полноатомной системы
С помощью графического конструктора CHARMM-GUI создана полноатомная система, состоящая из участка мембраны и интегрированного мембрано-протеинового SDH комплекса, необходимая для проведения моделирования молекулярной динамики . Исследуемая система создана в силовом поле CHARMM36. Система помещена в раствор, соответствующий физиологическому (0.15M NaCl, pH = 7), параметризован кофактор убихинон (UQ), а также железо-серные (2Fe-2S) кластеры (длины связей, константы жесткости связей, значения простых и двугранных углов и др.).
2.3. Моделирование молекулярной динамики
Запуск моделирования молекулярной динамики системы проведен с использованием пакета программ GROMACS . Температура процесса моделирования составила T = 303.15 K. Термостатирование динамики проводилось с помощью расширенного ансамбля Nose-Hoover и временной постоянной равной 1 пс, определяющей период флуктуации температуры при равновесии. Баростатирование проводилось с помощью ансамбля Parrinello-Rahman и временной постоянной равной 5 пс. Система для молекулярной динамики была помещена в ячейку с размером 10,63х10,63х20,20 нм, заполнена молекулами воды (TIP3P) с добавлением ионов хлора и натрия до концентрации 0,15 М и нейтрального суммарного заряда системы. Временной шаг интегрирования составил 2 фс.
2.4. Анализ и визуализация данных
Обработка данных проводилась в Python с использованием программного пакета NumPy . Построение графиков выполнено с помощью Matplotlib . Для визуализации структур использовали программный пакет PyMol .
3. Результаты и обсуждение
В исследуемой выборке вагальных параганглиом у одного из 36 пациентов идентифицирована миссенс мутация NM_003000: c.A307G, p.M103V (chr1: 17355211, rs140178341) в гене SDHB. Эта мутация была ранее зарегистрирована в базах данных dbSNP и ClinVar и выявлена в результате клинического тестирования при таких заболеваниях как параганглиомы/феохромоцитомы, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта, синдром Карни-Стратакиса, синдром Каудена, наследственный опухолевый синдром. Происхождение этой альтернативной аллели имело статус либо герминальный, либо неустановленный. На данный момент клиническая значимость варианта SDHB: p.M103V остается неопределенной.
Рисунок 1 - Положение метионина 103 в субъединице SDHB
Примечание: палочки, красный – Метионин 103; шарики, желто-оранжевый – 2Fe-2S кластеры
Рисунок 2 - Сравнение структуры нативной субъединицы SDHB и субъединицы c мутацией p.M103V
Примечание: голубой – белок дикого типа; розовый – мутантный белок; фиолетовый – бета-листы в структуре нативного белка; красный – бета-листы в структуре мутантного белка; шарики, желто-оранжевый – 2Fe-2S кластеры; а и б – разный ракурс в пространстве
Рисунок 3 - Структура 2Fe-2S кластера нативной субъединицы SDHB (а) и субъединицы c мутацией p.M103V (б)
Примечание: шарики, желто-оранжевый – 2Fe-2S кластеры
Полученные результаты моделирования молекулярной динамики мутации SDHB: p.M103V свидетельствует о ее патогенном эффекте на структуру белка, что также подтверждается многими другими предсказательными алгоритмами. Белок SDHB – это гидрофильная субъединица, содержащая три железо-серных кластера, которая образует границу раздела между каталитическим и мембранным якорным доменами в структуре сукцинатдегидрогеназы . In silico моделирование тетрамерного SDH комплекса показало широкий спектр биохимических последствий мутаций в гене SDHB . Ким с коллегами выявили несколько ключевых последствий SDHB мутаций:
1) полная потеря белка в результате нонсенс-зависимого распада и/или ускоренной деградации мРНК, а также нарушение стабильности и деградация самого белка;
2) нарушение импорта белка в митохондрии;
3) нарушение сборки SDH комплекса;
4) изменение функциональной активности сукцинатдегидрогеназы из-за изменений в активных центрах фермента .
В более ранних работах была продемонстрирована важность железо-серных кластеров импорте субъединицы SDHB в митохондрии и сборке зрелого SDH комплекса , . Таким образом, мы предполагаем, что исследуемая мутация SDHB: p.M103V может приводить к нарушению биогенеза и стабильности белка (нарушение включения 2Fe-2S кластеров в структуру белка), а также сборки SDH комплекса, что как следствие вызывает снижение активности сукцинатдегидрогеназы и способствует развитию заболевания.
4. Заключение
Моделирование молекулярной динамики показало, что мутация NM_003000: c.A307G, p.M103V (chr1: 17355211, rs140178341) вызывает серьезные структурные изменения в субъединице SDHB сукцинатдегидрогеназы, которые могут привести к нарушению ее стабильности и потере функции. Согласно результатам моделирования, данная мутация является вероятно патогенной. Кроме того, идентификация этой мутации у нашего пациента с ВПГ, а также других больных параганглиомами/феохромоцитомами (по данным ClinVar) при низкой популяционной частоте, также указывает на ее патогенный эффект и вовлеченность в развитие заболевания. Полученные результаты расширяют спектр патогенных/вероятно патогенных вариантов, связанных с параганглиомами головы и шеи.