ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНОВ С ОДНОЙ МИНОРНОЙ ЗАМЕНОЙ В ТИОФЕНОВОМ АДДЕНДЕ НА УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ NADPH-ОКСИДАЗЫ 4 В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТАХ ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА

Трошин П. А.; Краевая О. А.; Большакова В. С.; Савинов А. Л.; Вейко Н. Н.; Каменева Л. В.; Ершова Е. С.; Проскурнина Е. В.; Костюк С. В.; Савинова Е. А.

doi:10.60797/jbg.2024.26.3

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНОВ С ОДНОЙ МИНОРНОЙ ЗАМЕНОЙ В ТИОФЕНОВОМ АДДЕНДЕ НА УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ NADPH-ОКСИДАЗЫ 4 В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТАХ ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА

Научная статья

Костюк С. В.

Ершова Е. С.

Каменева Л. В.

Вейко Н. Н.

Савинов А. Л.

Краевая О. А.

DOI:

https://doi.org/10.60797/jbg.2024.26.3

Выпуск: № 4 (26), 2024

Предложена:

24.09.2024

Принята:

16.10.2024

Опубликована:

27.12.2024

52

2

XML

PDF

Аннотация

Поиск высокоэффективных антиоксидантов является актуальной медико-биологической задачей. Фуллерены и их производные обладают высокой антиоксидантной активностью, что делает их потенциальными препаратами для лечения заболеваний, вызванных активными формами кислорода. Целью данной работы было изучить влияние минорной замены (метильного радикала на карбоксиметильный) в одном из аддендов водорастворимых производных фуллерена С60 с общей формулой C60Ar5Th’Th’’H на уровень активных форм кислорода в клетках фибробластов легкого эмбриона человека в разных концентрациях и в разные временные интервалы. Показано, что производное фуллерена С60, не имеющее карбоксильной группы в качестве минорной замены, обладает более длительным (24 часа) антиоксидантным эффектом. Полученные данные свидетельствуют о высоком антиоксидантном потенциале данного соединения, что делает его перспективным объектом для дальнейшего изучения.

Ключевые слова:

производные фуллерена С60, активные формы кислорода, эмбриональные фибробласты легкого человека, NOX4.

1. Введение

Производные фуллеренов стали предметом интенсивных исследований в последние десятилетия. Фуллерены проявляют широкий спектр различной биологической активности и могут применяться в качестве вектора для доставки лекарств, противораковых

, , , , антивирусных , , , , антибактериальных препаратов , , а также для таргетной доставки веществ , , что делает их перспективными кандидатами, как для диагностики, так и для терапевтического применения. Благодаря наличию большого количества двойных сопряжённых связей фуллерены и их водорастворимые производные являются мощными акцепторами свободных радикалов, что делает этот класс соединений привлекательным инструментом для регулирования свободнорадикальных процессов и для снижения тяжести окислительного стресса в биологических системах , , , . Благодаря их высокой антиоксидантной активности водорастворимые производные могут применяться для лечения заболеваний, вызванных активными формами кислорода , , . Данное свойство делает эти наносоединения предметом интереса не только генетики и молекулярной биологии, но также и биофизики.

2. Методы и принципы исследования

2.1. Клеточные культуры

Клеточная культура эмбриональных фибробластов легкого человека (ФЛЭЧ) 4-го пассажа для данного исследования была предоставлена ФГБНУ «МГНЦ». Культивирование проводилось при температуре 37°C в среде DMEM (ПанЭко, Россия), обогащенной 20%-ной телячьей сывороткой (PAA Laboratories, Вена, Австрия). В среду добавляли 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10 мг/мл гентамицина (данные реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США)

. Клетки ФЛЭЧ инкубировали с водными растворами фуллеренов в CO2 инкубаторе при температуре 37°C в атмосфере 5%, в течение 1, 3 и 24 часов.

2.2. Производные фуллерена С60

В качестве объекта исследования использовали водорастворимые производные фуллеренов C60 c одной минорной заменой (присоединена карбоксильная группа к тиофен-радикалу). Синтез и спектральные данные полученных соединений представлены в работе .

Рисунок 1 - Химические формулы исследованных водорастворимых производных фуллеренов С60

2.3. МТТ-тест

Токсичность соединений определяли методом метилтетразолиевым теста (МТТ-тест). В основе данного метода лежит реакция восстановления желтого МТТ (метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромида) до пурпурного формазана с помощью дегидрогеназ митохондрий. Реакция протекает только в жизнеспособных клетках с функционирующими ферментами митохондрий. Измерение флуоресценции окрашенных клеток осуществлялось на приборе EnSpire Equipment (EnSpire Equipment, Турку, Финляндия), длина волны возбуждения составляла 𝜆ex = 488 нм, длина волны испускания 𝜆em = 528 нм. Эксперименты проведены не менее чем в восьми повторах.

2.4. Определение количества АФК

Уровень синтеза АФК в культуре клеток измеряли с помощью H2DCFH-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетата), данный краситель способен быстро проникать через клеточные мембраны, и гидролизоваться до DCFH в цитозоле гидролазами клетки. DCFH не флуоресцирует в клетках, но является чувствительным маркером окислительного стресса. При взаимодействии DCFH и АФК, данный краситель окисляется до флуоресцирующего DCF. Уровень синтеза АФК измерялся на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (Beckman Coulter). По окончании времени воздействия фуллерена на клетки добавлялся раствор H2DCFH-DA и проводился анализ изменения флуоресценции сигнала в зависимости от времени инкубации клеток в присутствии красителя. Скорость синтеза DCF отражает количество АФК в клеточной культуре.

2.5. Определение уровня экспрессии белка

Экспрессию белка оценивали методом проточной цитометрии с использованием специфических антител (CY5.5-NOX4 (bs-1091r-cy5-5, антитела Bioss, Inc. Воберн, Массачусетс, США) на проточном цитофлуориметре CyFlow Space (Partec, Meckenheim, Германия).

2.6. Оценка уровня мРНК

Оценка экспрессии генов производилась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Выделение РНК после воздействия фуллеренов на клетки осуществлялось по стандартной методике набора YellowSolve (Клоноген, Санкт-Петербург, Россия). Измерение концентрации РНК проводилось на планшетном ридере (EnSpire, Турку, Финляндия), λ ex = 487 нм, λ fl = 524 нм. Для проведения реакции обратной транскрипции по стандартной методике использовали реагенты фирмы Sileks (Москва, Россия). ПЦР проводили с использованием соответствующих праймеров (Synthol) и смеси SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Калифорния, США) на приборе StepOnePlus (Applied Biosystems, Калифорния, США). Погрешность составила около 2%. В качестве гена референса использовался TBP

.

3. Основные результаты

Исследовали влияние водорастворимых производных фуллеренов F-167 и F-99. Для оценки цитотоксичности исследуемых соединений в отношении нормальных клеток человека – ФЛЭЧ – был проведён МТТ-тест (рисунок 2). Фуллерены добавлялись в среду в начале культивирования ФЛЭЧ. Длительность культивирования составляла 72 часа.

Рисунок 2 - Выживаемость клеток линии ФЛЭЧ в присутствии фуллеренов по результатам МТТ-теста:

А – F-167; Б – F-99

Примечание: данные МТТ теста представлены в виде среднего значения, вертикальные линии указывают на максимальное и минимальное значения выживаемости для определенной концентрации фуллерена; по оси Х – концентрации фуллеренов, обозначены на рисунке; по оси Y – оптическая плотность при 570 нм; зеленая линия – контроль, по оси ординат отложены значения МТТ-теста относительно контрольного образца (клетки, культивируемые без производных фуллерена)

Для дальнейшего исследования воздействия производных фуллеренов на уровень АФК в клетках ФЛЭЧ были выбраны две концентрации каждого соединения, входящие в диапазон нетоксичных концентраций фуллеренов: низкая – 18 нг/мл и более высокая – 28 мкг/мл; и три времени инкубации клеток с соединениями - 1, 3 и 24 часа. Исследовался уровень синтезируемых АФК с помощью DCF. На рисунке 3 приводятся зависимости уровня синтеза DCF в клетках при концентрациях фуллеренов 18 нг/мл и 28 мкг/мл к контролю (клеткам, культивируемым без фуллеренов) от времени. При добавлении к клеткам производного фуллерена F-167 наблюдается снижение уровня АФК через 1 час, исследуемое соединение продолжает связывать АФК в течение 24 часов – уровень АФК не достигает в клетках физиологического уровня, а остается пониженным, хоть и возрастает со временем. При культивировании производного F-99 с клетками ФЛЭЧ в концентрациях 18 нг/мл и 28 мкг/мл наблюдается снижение уровня АФК через 1 час, в течение 3 часов уровень АФК в клетках снижается на 30-40%, а через 24 часа уровень АФК повышается на 15-30% (рисунок 3).

Зависимость уровня синтеза DCF в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени

Рисунок 3 - Зависимость уровня синтеза DCF в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени

Примечание: 1, 3, 24 часа инкубации

NADPH-оксидазы являются одним из источников образования АФК (супероксидного радикала) в клетках. NADPH-оксидаза 4 (NOX4) одна из типов экспрессирующийся в фибробластах NADPH-оксидаз, экспрессия которого регулируется на уровне гена. В данной работе был исследован уровень экспрессии NOX4 на уровне гена и белка в клетках (ФЛЭЧ) после инкубации производных фуллеренов (F-167 и F-99) в концентрациях 18 нг/мл и 28 мкг/мл в различных интервалах времени (1, 3, 24 часа). При действии на клетки производного фуллерена F-167 в концентрации 28 мкг/мл через 24 часа после начала инкубации с соединением достоверно (p <0,01) возрастает уровень экспрессии NOX4 в 1,5 раза на уровне белка, и в 1,7 раз на уровне гена (рисунок 4 (Б), 5 (Б)). При действии на клетки производного фуллерена F-99 концентрациях 18 нг/мл и 28 мкг/мл возрастает уровень экспрессии NOX4 в 1,4-2,1 раз на уровне гена и белка через 3-24 часа после начала инкубации с соединениями (рисунок 4, 5). Повышение уровня экспрессии белка NOX4 через 24 часа инкубации клеток с исследуемыми соединениями может объяснить, почему возрастает уровень АФК в клетках через 24 часа после добавления, данного соединений к ФЛЭЧ.

Рисунок 4 - Уровень белка NOX4 в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени

Примечание: 1, 3, 24 часа инкубации; * – достоверные отличия с контрольными клетками, p <0,01, непараметрический U-тест

Уровень экспрессии гена NOX4 в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени

Рисунок 5 - Уровень экспрессии гена NOX4 в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени

Примечание: 1, 3, 24 часа инкубации; * – достоверные отличия с контрольными клетками, p <0,01, непараметрический U-тест

4. Обсуждение

Вероятно, при добавлении производных фуллеренов F-99 и F-167 к клеткам ФЛЭЧ в среду культивирования, данные соединения работают как акцепторы свободных радикалов на протяжении 3 часов, что можно отследить по уровню АФК. Однако уровень экспрессии NOX4 различается для этих соединений, как на уровне белка, так и на уровне гена в интервале 1-24 часа. Уровень транскрипционной активности NOX4 выше для F-99, чем для F-167 от 1 до 24 часов, а следовательно ферментный комплекс не только успевает синтезироваться в достаточном количестве, но и начинает активно функционировать, в связи с резким падением уровня АФК, что объясняет высокий уровень АФК после 24 часов при воздействии F-99.

5. Заключение

Исследованные водорастворимые производные фуллерена С60 с одной минорной заменой (метильного радикала на карбоксиметильный) активно участвуют в гомеостазе АФК в клетках ФЛЭЧ. Был изучен большой диапазон концентраций и выбраны две для каждого соединения – 18 нг/мл (концентрация, входящая в диапазон нетоксичных концентраций фуллеренов); и концентрация, близкая к повреждающей – 28 мкг/мл. При добавлении в среду культивирования клеток ФЛЭЧ in vitro соединения показали себя как эффективные антиоксиданты в первые 3 часа инкубации, наиболее эффективным антиоксидантом оказалось производное фуллерена F-167 в концентрации 18 нг/мл. Наблюдалось повышение уровня АФК через 24 часа культивирования ФЛЭЧ в присутствии исследуемого соединения F-99 связано с усилением транскрипционной активности гена NOX4, приводящей к увеличению экспрессии белка NOX4. Таким образом, данное исследование открывает новые перспективы использования фуллеренов и их производных и дает предпосылки к дальнейшему подробному изучению влияния на клетки человека.

Дополнительные материалы

Не указаны

Финансирование

Российский научный фонд (РНФ)
Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проект 22-43-08005).

Благодарности

Не указаны

Конфликт интересов

Не указаны

Список литературы

Yin R. Photodynamic therapy with decacationic [60] fullerene monoadducts: Effect of a light absorbing electron-donor antenna and micellar formulation / R. Yin, M. Wang, Y. Huang [et al.] // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. — 2014. — № 4. — P. 795–808.
Raffaini G. A molecular dynamics study of a photodynamic sensitizer for cancer cells: Inclusion complexes of γ-cyclodextrins with C70 / G. Raffaini, F. Ganazzoli // International Journal of Molecular Sciences. — 2019. — № 20.
Zhou W. Aminated Fullerene Abrogates Cancer Cell Migration by Directly Targeting Myosin Heavy Chain 9 / W. Zhou, J. Huo, Y. Yang [et al.] // ACS Appl. Mater. Interfaces. — 2020. — № 12. — P. 56862–56873.
Serda M. Development of photoactive Sweet-C 60 for pancreatic cancer stellate cell therapy / M. Serda, M.J. Ware, J.M. Newton [et al.] // Nanomedicine. — 2018. — № 23. — P. 2981–2993.
Watanabe T. Pyrrolidinium fullerene induces apoptosis by activation of procaspase-9 via suppression of Akt in primary effusion lymphoma / T. Watanabe, S. Nakamura, T. Ono [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. — 2014. — № 1. — P. 93–100.
Friedman S.H. Inhibition of the HIV-1 Protease by Fullerene Derivatives: Model Building Studies and Experimental Verification / S.H. Friedman, D.L. DeCamp, G.L. Kenyon [et al.] // Journal of the American Chemical Society. — 1993. — № 115. — P. 6506–6509.
Voronov I.I. Synthesis and Antiviral Activity of Water-Soluble Polycarboxylic Derivatives of [60]Fullerene Loaded with 3,4-Dichlorophenyl Units / I.I. Voronov, V.M. Martynenko, A.V. Chernyak [et al.] // Chem Biodivers. — 2018. — № 11.
Hirayama J. Photoinactivation of vesicular stomatitis virus with fullerene conjugated with methoxy polyethylene glycol amine / J. Hirayama, H. Abe, N. Kamo [et al.] // Biol Pharm Bull. — 1999. — № 10. — P. 1106–1109.
Lyon D.Y. Antibacterial activity of fullerene water suspensions: Effects of preparation method and particle size / D.Y. Lyon, L.K. Adams, J.C. Falkner [et al.] // Environ Sci Technol. — 2006. — № 14. — P. 4360–4366.
Tan Y. Facile construction of fluorescent C70-COOH nanoparticles with advanced antibacterial and anti-biofilm photodynamic activity / Y. Tan, Y. Ma, S. Fu [et al.] // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. — 2020. — № 234.
Shoji M. Correction: Anti-Influenza Activity of C 60 Fullerene Derivatives / M. Shoji, E. Takahashi, D. Hatakeyama [et al.] // PLoS One. — 2013. — № 6.
Cho M. Escherichia coli inactivation by UVC-irradiated C60: Kinetics and mechanisms / M. Cho, S.D. Snow, J.B. Hughes [et al.] // Environmental Science & Technology. — 2011. — № 22. — P. 9627–9633.
Mashino T. Inhibition of E. coli growth by fullerene derivatives and inhibition mechanism / T. Mashino, K. Okuda, T. Hirota [et al.] // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. — 1999. — № 20. — P. 2959–2962.
Tsao N. In vitro action of carboxyfullerene / N. Tsao, T.Y. Luh, C.K. Chou [et al.] // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. — 2002. — № 4. — P. 641–649.
Äärelä A. Synthesis of Site-Specific Antibody-[60]Fullerene-Oligonucleotide Conjugates for Cellular Targeting / A. Äärelä, K. Räsänen, P. Holm [et al.] // ACS Appl Bio Mater. — 2023. — № 8. — P. 3189–3198.
Al-Anbari H.H. Investigating a nickel-decorated fullerene for adsorbing tespa anticancer: drug delivery assessments / H.H. Al-Anbari, Z.A.A. Mahdi, H. Zandi [et al.] // Journal of Molecular Modeling. — 2022. — № 12.
Wang I.C. C60 and water-soluble fullerene derivatives as antioxidants against radical-initiated lipid peroxidation / I.C. Wang, L.A. Tai, D.D. Lee [et al.] // Journal of Medicinal Chemistry. — 1999. — № 22. — P. 4614–4620.
Monti D. C60 carboxyfullerene exerts a protective activity against oxidative stress-induced apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells / D. Monti, L. Moretti, S. Salvioli [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2000. — № 3. — P. 711–717.
Gharbi N. [ 60 ] Fullerene is an in vivo Powerful Antioxidant With no Acute or Sub-acute Toxicity / N. Gharbi, M. Pressac, M. Hadchouel [et al.] // Nano Letters. — 2005. — № 12. — P. 2578–2585.
Grebowski J. Fullerenol C60(OH)36 Protects the Antioxidant Enzymes in Human Erythrocytes against Oxidative Damage Induced by High-Energy Electrons / J. Grebowski, P. Kaźmierska-Grębowska, N. Cichoń [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. — 2022. — № 23. — 10939. — DOI: 10.3390/ijms231810939.
Kuznietsova H. Water-Soluble Pristine C60 Fullerenes Inhibit Liver Fibrotic Alteration and Prevent Liver Cirrhosis in Rats / H. Kuznietsova, N. Dziubenko, V. Hurmach [et al.] // Oxid Med Cell Longev. — 2020. — 8061246. — P. 14.
Vereshchaka I.V. C60 fullerenes diminish muscle fatigue in rats comparable to N-acetylcysteine or β-Alanine / I.V. Vereshchaka, N.V. Bulgakova, A.V. Maznychenko [et al.] // Front Physiol. — 2018. — № 9.
Xiao L. Antioxidant effects of water-soluble fullerene derivatives against ultraviolet ray or peroxylipid through their action of scavenging the reactive oxygen species in human skin keratinocytes / L. Xiao, H. Takada, K. Maeda [et al.] // Biomedicine & Pharmacotherapy. — 2005. — № 7. — P. 351–358.
Proskurnina E.V. Effects of aqueous dispersions of c60, c70 and gd@c82 fullerenes on genes involved in oxidative stress and anti-inflammatory pathways / E.V. Proskurnina, I.V. Mikheev, E.A. Savinova [et al.] // Int J Mol Sci. — 2021. — № 11.
Bolshakova V.S. A regioselective step-by- step C60Cl6 functionalization approach affords a novel family of C60Ar5Th′Th′′H fullerene derivatives with promising antiviral properties / V.S. Bolshakova, O.A. Kraevaya, A.S. Peregudov [et al.] // Chem. Commun. — 2023. — № 59. — P. 3882–3885.

Рецензия

Все статьи проходят рецензирование. Но рецензент или автор статьи предпочли не публиковать рецензию к этой статье в открытом доступе. Рецензия может быть предоставлена компетентным органам по запросу.