UNCOVERING THE IN SILICO REGULATORY POTENTIAL OF MICROSATELLITE SEQUENCES IN GLYCINE MAX (L.) MERR.

Сателлитная ДНК состоит из множества тандемных повторов, которые играют важную роль в клеточных процессах, включая сегрегацию хромосом, организацию генома и защиту концевых участков хромосом. Большинство повторов сателлитной ДНК имеют либо нуклеосомную длину, либо 5–10 п.н. и занимают центромерные, перицентромерные или теломерные области. Для сателлитных ДНК некоторых организмов были идентифицированы несколько консервативных сателлит-специфичных последовательностей, кривизна ДНК, симметрии диад и перевернутые повторы. Последовательности сателлитной ДНК либо встроены в высококомпактный гетерохроматин с низким содержанием генов, либо в специализированный хроматин, отличный от эухроматина. Тем не менее некоторые сателлитные ДНК транскрибируются в некодирующие РНК, которые могут играть важную роль в генной регуляции. Сателлитная ДНК является одной из наиболее эволюционно-изменчивых структур, что обуславливает высокую видовую специфичность

Сателлитная ДНК классифицируется на микросателлиты: это короткие повторяющиеся последовательности ДНК, длина которых варьируется от 2 до 5 нуклеотидов, минисателлиты – это более длинные повторяющиеся последовательности ДНК, длина которых может варьироваться от 10 до 100 нуклеотидов и макросателлиты – это самый длинный тип сателлитной ДНК с повторяющимися единицами длиной от 100 до нескольких тысяч нуклеотидов

SSR (Simple Sequence Repeats) или по другому называемые у человека STR (Short Tandem Repeats) — это повторяющиеся короткие не кодирующие последовательности генома. Свойство микросателлитов накапливать большое количество нуклеотидных замен обуславливает разный вид и длину схожих участков у разных представителей одного вида, что позволяет использовать сателлитную ДНК в криминалистике, для определения родства, составления генеалогического древа, а также при картировании генов

SSR вызывают большой интерес у исследователей, поскольку могут быть использованы для выявления генетических вариаций между разными растениями, а также для изучения эволюции различных видов. SSR-локусы полезны для понимания генетики признаков растений, таких как устойчивость к болезням, засухоустойчивость и адаптация к изменениям окружающей среды. Они также могут помочь понять механизмы реагирования растений на различные условия окружающей среды и как они взаимодействуют с другими организмами в своих экосистемах

Известно, что некоторые мутации микросателлитов способны стать причиной заболеваний. Имеется информация об оказании влияния на процесс сплайсинга

Энхансеры — это особые участки генома, действующие как сайты связывания специфичных для гена факторов транскрипции. В отличие от промоторов, энхансеры могут находиться на большом расстоянии от гена или даже находиться на другой хромосоме от него. По степени влияния на транскрипцию гена энхансеры могут быть разделены на несколько типов, сильные, сбалансированные, слабые и не активные

Микросателлитная ДНК может являться энхансером у растений. Ранее исследователи уже использовали SSR для регуляции экспрессии определенных генов в растениях. Например, анализировали микросателлиты участвующие в повышении устойчивости Arabidopsis thaliana за счет повышения их сопротивления к водному стрессу

SSR имеют различные мотивы, знания о которых может быть использовано для создания искусственных энхансеров в растениях путем введения этих последовательностей ДНК в геном растения. Это позволит увеличивать эксперессию гена-мишени у растения путем вставки специфичных для энхансеров мотивов рядом с геном

Знания о последовательностях генома, отвечающих за регуляцию экспрессии определённых генов могут помочь в селекционной работе, позволяя отбирать для дальнейшей гибридизации наиболее подходящие генотипы. Поэтому в нынешний период развития пост-геномных технологий, где требуется решение современных задач в сельском хозяйстве, знание и понимание функционального назначения того или иного генетического конструкта могут оказать решающую роль.

В данном исследовании была поставлена цель — спрогнозировать энхансерный потенциал наиболее изученных и популярных SSR-локусов и определить их сайты связывания с транскрипционными факторами.

Для проведения анализа из открытой базы данных о геноме сои министерства сельского хозяйства США "SOYBASE.ORG" была взята информация о нуклеотидных последовательностях известных микросателлитных локусах. Критерием отбора локусов являлось наличие информации о первичной последовательности ДНК. Для идентификации последовательности как энхансер, а также для определения силы этой последовательности был использован сервис iEnhancer-2L.

iEnhancer-2L — инструмент на основе PseKNC (Pseudo K-tuple Nucleotide Composition/Псевдо К-картежный нуклеотидный состав) выполняющий двухуровневое предсказание, на первом этапе которого производятся расчёты того является ли последовательность поступившая на входе энхансером, после чего, в случае положительного результата, программа переходит на второй этап, а именно на проверку силы предсказанного энхансера. Работает данная программа на основе машинного обучения по эталонным данным методом «складного ножа». Обучающий набор данных, включал информацию о 742 сильных энхансеров, 370517 слабых энхансеров и 5257994 неэнхансеров. На основание этого обучающегося набора, данный сервис строит прогноз о возможном наличии энхансера в качестве подстроки в предоставленной последовательности. Данные, поступившие на вход программы в формате FASTA или в виде нуклеотидной последовательности разбиваются на отрезки по 200 н.п. и с шагом в 1 н.п. идет их анализ. Последовательности длинной менее 200 н.п. распознаются как не энхансер

Для определения возможных сайтов связывания транскрипционных факторов на обнаруженных энхансерах был использован программный пакет SITECON от Unipro UGENE, основанный на наборе данных о консервативных конформационных и физико-химических свойствах, выявленных на основе анализа наборов известных сайтов связывания. Для анализа была выбрана модель "GATA" представляющая собой семейство факторов транскрипции со способностью связаться с последовательностями GATA в ДНК

Из базы данных SOYBASE.ORG были отобраны нуклеотидные последовательности 935 микросателлитных локусов, обладающих мотивами AT и ATT. После чего на iEnhancer-2L была проанализирована каждая последовательность. В результате из общего количества микросателлитов были отобраны 101, обладающие возможной энхансерной функцией.

Микросателлиты, среди которых были найдены возможные энхансерные последовательности, были разделены по характерным для них мотивам АТТ и АТ. Для мотива АТТ среди 602 микросателлитных маркеров было найдено 62, содержащих последовательности, имеющие разную теоретическую энхансерную силу (табл. 1).

Общее количество микросателлитных маркеров с мотивом АТ составило 333, а всего среди них локусов обладающих возможными энхансерными последовательностями 39 (табл. 2).

Среди общего количества микросателлитных маркеров сильными энхансерными последовательностями обладали 42, из которых 28 с мотивом АТТ и 13 с мотивом АТ. Помимо этого, особо выделялись Satt701, Satt582, Satt311, Satt136, Satt122, Satt115, Satt080, sat_100, обладающие большим количеством энхансерных последовательностей (более 50).

SSR обладающие большим количеством сильных энхансерных последовательностей были проанализированы на наличие сайтов связывания транскрипционного фактора нацеленного на мотив GATA с использованием SITECON via Unipro UGENE (табл. 3).

Из этого числа SSR было обнаружено 6: Sat_100, Satt581, Satt582, Satt122, Satt115, Satt080 имеющие сайты связывания транскрипционных факторов, пересекающиеся с регионами, спрогнозированными как потенциальные энхансеры. Satt311 и Satt136 не имели нуклеотидного консенсуса, что может быть объяснено несоответствием GATA Sitecon с прогнозом IEnhancer-2L. Возможно регуляторный потенциал данных SSR-локусов будет раскрыт в последующих работах с применением других Sitecon моделей.

Для визуализации полученных данных на примере Sat_100 была построена аннотационная карта, где наглядно представлены области пересечения предсказанных энхансеров с сайтами связывания, имеющих сродство к транскрипционным факторам (рис. 1).

Рисунок 1 - Аннотационная карта микросателлита Sat_100 с длиной 495 п.н

DOI:10.60797/jbg.2025.28.1.4

На основании пересечения регионов, спрогнозированных как энхансеры с участками, имеющие потенциал к связыванию TFBS, можно утверждать о релевантности представленного кроссвалидационного способа по раскрытию регуляторного потенциала у некоторых микросателлитных локусов.

В числе взятого из базы данных SOUYBASE.ORG общего количества микросателлитных маркеров имеются 42 возможных энхансера, предсказанных iEnhancer-2L. При этом среди микросателлитов с мотивом АТТ предполагается энхансерная активность у 45%, у мотива АТ — 33%. При этом отличающихся по большому количеству именно сильных последовательностей было 7 микросателлитных маркеров, из которых 6 имели мотив АТТ и 1 — мотив АТ. По нашему мнению, имеется взаимосвязь между тандемной повторностью и силой энхансера. Так, последовательности с мотивом АТТ имели большее количество сайтов GATA и, как правило, обладали большей силой и соотношением энхансеров к не-энхансерам. Известные микросателлитные локусы, чья функция до сих пор не описывалась, могут иметь регуляторную функцию: усиливать экспрессию генов. На следующих этапах следует проводить поиск предполагаемых генов-мишеней для этих локусов с целью экспериментально подтвердить регуляторное влияние SSR-локусов на экспрессию генов. Для экспериментального подтверждения проведённых исследований требуется использование методик, таких как иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием, полногеномное картирование модификаций гистонов. Как результат биоинформатическое прогнозирование функций SSR — актуальное направление для исследований, ввиду возможности предварительного скрининга и отсеивания тех последовательностей чья функция выходит за рамки позитивной регуляции экспрессии генов.