1. Введение

Длинные некодирующие РНК (днкРНК) – это транскрипты длиной более 200 нуклеотидов, которые не кодируют белок, но могут взаимодействовать с другими биологическими молекулами (нуклеиновыми кислотами и белками) через определенные последовательности или структурные элементы [1]. ДнкРНК широко вовлечены в молекулярные процессы, регулирующие онкогенез, и могут модулировать как онкогенные, так и супрессирующие опухоль эффекты посредством усиления или подавления экспрессии генов [2]. ДнкРНК – это важные, но малоизученные компоненты многочисленных клеточных сетей, поэтому понимание их клинической и теоретической значимости является актуальной научной задачей. Особый интерес к днкРНК вызвало появление ингибиторов in vivo в форме антисмысловых олигонуклеотидов, что открывает многообещающие перспективы для использования днкРНК в качестве терапевтических мишеней при раке [3], [4]. Кроме того, днкРНК могут служить диагностическими и прогностическими биомаркерами опухолей [5].

Гены днкРНК, также, как и белок-кодирующие гены, имеют склонность к мутациям в опухолях [6]. Масштабное исследование однонуклеотидных полиморфизмов набора данных «Панракового анализа целых геномов» (PCAWG) позволило выявить 17 драйверных днкРНК, включая 9 днкРНК, для которых ранее была показана связь с онкогенезом [7]. Авторы также показали, что экспрессия днкРНК LOLI1 (RP11-572M11.1, ENSG00000241219), мутированной по нескольким однонуклеотидным полиморфизмам, повышает жизнеспособность трансформированных и нормальных гепатоцитов человека. Введение полиморфизмов в днкРНК NEAT1 приводило к значительному увеличению количества и размера субъядерных параспекл, которые удерживают разнообразные регуляторные белки и РНК, влияя на паттерны экспрессии генов и белков в клетке [7]. При этом параспеклы обнаруживаются в опухолевых клетках и могут быть ассоциированы с плохим прогнозом [8]. Таким образом, варианты в генах днкРНК могут нарушать функцию кодируемых транскриптов, способствовать пролиферации и росту клеток, а также иметь онкогенное значение.

Параганглиомы головы и шеи (ПГШ) относятся к редким типам опухолей и встречаются c частотой 0,3-1 на 100 000 случаев [9]. ПГШ объединяют группу опухолей, которые возникают из парасимпатических параганглиев, с наиболее частой локализацией в месте бифуркации сонной артерии, вдоль блуждающего нерва и области среднего уха [10]. Из-за анатомического расположения, вялотекущего течения заболевания и слабой симптоматики эти опухоли сложно диагностировать и лечить. Между тем, ПГШ могут метастазировать и характеризоваться мультифокальным ростом, часто имеют наследственную генетическую предрасположенность и ассоциированы с опухолевыми синдромами [11]. Однако большинство ПГШ развиваются спорадически вследствие соматических нарушений, которые до сих пор малоизучены.

Данное исследование посвящено анализу генетических вариантов в генах днкРНК при ПГШ с использованием собственных экзомных данных, полученных для репрезентативной выборки этих опухолей. ПГШ не представлены в публичных геномных базах данных (за исключением единичных случаев, встречающихся в выборке феохромоцитом), таких как «Атлас ракового генома» (TCGA) или PCAWG, поэтому исследование вариантов в днкРНК для этих опухолей ранее не проводилось. Этот пилотный анализ поможет выявить мутированные днкРНК, которые могут быть вовлечены в развитие ПГШ.

2. Материалы и методы

Источником для анализа генов днкРНК были собственные данные секвенирования экзомов 152 архивных опухолевых тканей ПГШ, заключенные в парафиновые блоки (FFPE), и 57 доступных нормальных тканей от тех же самых пациентов (кровь или лимфатический узел). Выборка опухолевых тканей включала: 70% (106/152) каротидных параганглиом, 22% (34/152) вагальных параганглиом и 8% (12/152) параганглиом среднего уха. Образцы собраны в 2006-2024 гг. и охарактеризованы в ФГБУ «НМИЦ хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России (ИХВ). Исследование одобрено этическим комитетом ИХВ и проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией (1964).

ДНК из тканей была выделена с помощью набора FFPET DNA Isolation Kit (Roche, Швейцария). Концентрация ДНК на флуориметре Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Для подготовки экзомных библиотеки использовали набор фирмы Illumina – TruSeq Exome Library Prep Kit (США). Секвенирование проводили на приборе Illumina NextSeq500 System (США) в режиме парных прочтений длиной 75 х 2 нуклеотидов. Все процедуры выполнены согласно протоколам производителей.

Анализ экзома выполнен согласно ранее описанному алгоритму [12]. Программу FastQC (версия 0.11.9) применяли для оценки качества прочтений. Далее проводили обрезку последовательностей, удаление адаптеров и фильтрацию по качеству с использованием Trimmomatic (версия 0.39). Полученные чтения были сопоставлены с референсным геномом человека GRCh37/hg19 (Ensembl, версия 75) с использованием bowtie2 (версия 2.4.1). Файлы BAM процессировали с помощью samtools (версия 1.10) и picard-tools (версия 2.21.3). Для определения генетических вариантов применяли GATK HaplotypeCaller (версия 4.1.4.0). Статистическая обработка выполнена согласно внутренним алгоритмам используемых программ. Для аннотации вариантов использовали программу ANNOVAR (после обновления 2022Aug02).

Фильтрация генетических вариантов в генах днкРНК проводилась с учетом максимальной частоты аллеля в популяции ≤ 1% по базам данных gnomAD, 1000 Genomes, ExAC и Kaviar и покрытием альтернативной аллели ≥ 10. Варианты со статусом «доброкачественный» или «вероятно доброкачественный» по базе данных ClinVar были исключены из анализа.

3. Результаты и обсуждение

В результате анализа экзомных данных ПГШ выявлено 88 вариантов в генах днкРНК, из которых заданные фильтры прошли 5 однонуклеотидных замены в четырех генах днкРНК – H3F3AP4, HIF1A-AS1, HIF1A-AS3 и TET2-AS1 (Таблица 1).

Практически все варианты, за исключением HIF1A-AS1: C>T (14:62162430), располагались в области интронов. Большинство вариантов ранее были аннотированы в базе данных NCBI SNP, однако их клиническая значимость не установлена. Варианты HIF1A-AS1: C>T (14:62162430) и TET2-AS1: G>A (4:106163909) обнаружены в опухолевой и нормальной тканях нескольких пациентов, что свидетельствует об их герминальном статусе. Более того, значение частоты альтернативного варианта около 0,5 в опухолях без доступной нормальной ткани (169tj, 180tj и 055tc) также указывает на их вероятную наследственную природу. Как отмечалось выше, риск развития ПГШ часто обусловлен наследственной предрасположенностью, поэтому герминальные варианты в генах днкРНК могут быть одним из компонентов наследственного генетического профиля, способствующего развитию этих опухолей. Среди различных типов опухолей, наибольшая частота мутаций в генах днкРНК наблюдалась при параганглиомах среднего уха (8% для вариантов в H3F3AP4 и HIF1A-AS3), следом при вагальных параганглиомах (3% для HIF1A-AS3 и TET2-AS1) и каротидных параганглиомах (0,9% и 2% для TET2-AS1 и HIF1A-AS1, соответственно). Более высокая частота вариантов при параганглиомах среднего уха может быть обусловлена небольшим размеров выборки этих опухолей (12 образцов).

Каждый из вариантов в генах днкРНК H3F3AP4, HIF1A-AS1, HIF1A-AS3 и HIF1A-AS3 встречался только в одном из 152 исследованных образцов опухолей (~0,66%), в то время как вариант в TET2-AS1 обнаружен в трех случаях (~2%). Более высокая частота варианта в гене днкРНК TET2-AS1 при ПГШ с одновременно низкой популяционной частотой в доступных референсных базах данных (0,5% по gnomAD и др.) может свидетельствовать о его патогенном эффекте. С другой стороны, это также может указывать и на нейтральное действие варианта.

ДнкРНК H3F3AP и TET2-AS1 мало описаны в литературе и их роль в онкогенезе остается неясной. ДнкРНК HIF1A-AS1 и HIF1A-AS3 являются антисмысловыми транскриптами гена HIF1a. Показано, что HIF1A-AS1 участвует в регуляции апоптоза и пролиферации гладкомышечных клеток сосудов и звездчатых клеток печени человека [13], [14]. Также сообщалось о повышение экспрессии HIF1A-AS1 при колоректальном раке [15], гепатоцеллюлярной карциноме [16] и раке поджелудочной железы [17]. Дерегуляция экспрессии этой днкРНК может способствовать как прогрессированию опухолей, так и оказывать онкосупрессорный эффект через активацию апоптоза [18]. Еще одна из трех HIF1a-ассоциированных днкРНК HIF1A-AS3 исследована менее обширно, показано, что она способствует прогрессии состояния гипоксии при раке яичников [19]. Одним из механизмов развития ПГШ считают состояние псевдогипоксии, возможно, днкРНК HIF1A-AS3 также вовлечена в этот онкогенный процесс.

Данное исследование лимитировано набором доступных генетических данных – экзомы охватывают преимущественно белок-кодирующие регионы ДНК, в то время как гены днкРНК часто располагаются в межгенных областях, интронах и энхансерах. Для всестороннего профилирования вариантов в генах днкРНК необходимо полногеномное секвенирование. Для проверки онкогенного эффекта выявленных вариантов в генах днкРНК необходимо проведение экспериментальных исследований с использованием клеточных линий и модельных организмов.

4. Заключение

Полноэкзомный анализ ПГШ выявил однонуклеотидные замены в четырех генах днкРНК: H3F3AP4, HIF1A-AS1, HIF1A-AS3 и TET2-AS1. ДнкРНК H3F3AP4 и TET2-AS1 мало описаны в литературе и их функция не изучена. Для двух днкРНК, HIF1A-AS1 и HIF1A-AS3, ранее была показана вовлеченность в онкогенез посредством участия в регуляции апоптоза и ответа на гипоксию, соответственно. В гене днкРНК TET2-AS1 идентифицирован генетических вариант G>A (4:106163909), который встречался в 2% исследуемых опухолей, что может указывать на его патогенное действие и вовлеченность в развитие ПГШ. Возможно, идентифицированные варианты могут оказывать влияние на функцию днкРНК и способствовать дерегуляции важных онко-ассоциированных молекулярных путей при ПГШ.

The additional file for this article can be found as follows: