1. Введение

Товарное выращивание рыб в аквакультуре становится реальной альтернативой так называемому пастбищному рыбному хозяйству, при котором основная масса рыбы добывается из естественных водоёмов. Комплекс факторов, среди которых не последнее место занимает нерациональный промысел, привёл к тому, что ряд ценных видов рыб, прежде многочисленных, полностью потеряли своё промысловое значение. Это в полной мере относится и к осетровым рыбам Каспийского моря, ежегодная добыча которых в 70–80-х годах ХХ века достигала порядка 20 тыс. тонн и более

[24]

Культивирование рыбы в искусственных условиях сопряжено с воздействием на рыб разнообразных стресс-факторов. Это плотные и сверхплотные посадки с целью интенсификации производства, многочисленные технологические манипуляции с рыбами, не всегда полноценное питание и многие другие

[26][30][28][27]

Общая резистентность организма является интегральным показателем адаптационных возможностей при внешних негативных воздействиях. Обеспечивается многими механизмами, в том числе и деятельностью иммунной и связанной с ней системами. Современные представления об адаптационных механизмах показывают, что их неспецифические компоненты функционируют на основе уже сформировавшихся физиологических процессов

[23][25]

Специфика аквакультуры заключается, в частности, и в том, что рыбы постоянно находятся в искусственных условиях, и поэтому может быть необходимость оценки жизнестойкости рыб, их адаптационного потенциала в любой момент времени. Поиск и практическое применение тест-показателей качества рыб в аквакультуре проводился авторами работы и ранее

[11][12]

2. Методы и принципы исследования

Рыбы до осуществления экспериментов, содержались в установке замкнутого водоснабжения (УЗВ). Опыты с функциональной нагрузкой проводились в лаборатории кафедры гидробиологии и общей экологии Астраханского государственного технического университета.

Работы проводились с бестером, гибрид белуга х стерлядь (

До начала эксперимента рыбы были адаптированы к новым условиям в течение двух недель. Рыбы содержались в бассейнах, объём бассейна — 0,5 м3Missing Mark : sup, бассейны были объединены в УЗВ по десять бассейнов в одной системе. Для экспериментов использовались аквариумы объёмом 300 л и 70 л, снабжённые биофильтрами. При проведении опыта с функциональной нагрузкой водообмен и аэрация были отключены.

Условия проведенных исследований соответствовали общепринятым нормам и требованиям этических и правовых норм. Все манипуляции с рыбой, включая транспортировку, забор крови и содержание в течение экспериментов, проводились согласно принципам Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным, директиве Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых для научных целей, ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», утвержденному Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии № 1700-ст от 20 ноября 2014 г.

Был проведён опыт с функциональной нагрузкой для определения наиболее устойчивых рыб. В качестве стресс-фактора применили пониженный уровень растворённого в воде кислорода при повышении температуры воды до 280С, оптимальной температурой воды для культивирования бестера считается 20–22oMissing Mark : supС

[21]

Перед тестированием у всех подопытных рыб предварительно была отобрана кровь пункцией из сосуда хвостового стебля. Рыбы были индивидуально помечены красителем. Отмечалось время выживания каждой рыбы.

Выбор временных точек контроля (0, 210, 420 мин) связан с динамикой снижения содержания в воде кислорода и критическими фазами гибели рыб: 0 мин — старт эксперимента, 210 мин (3,5 часа) — момент, когда гипоксия начинает проявлять выраженное влияние (концентрация кислорода опускается ниже 2,5 мг/л), 420 мин (7 часов) — точка, после которой выживаемость рыб резко падает, и эксперимент теряет информативность.

Было проведено три серии опытов, в каждой серии — три повторности по 20 экз. рыб.

Перед отбором крови производилась анестезия (трикаинметанесульфанат в концентрации 0,05 г/л, экспозиция 3 минуты)

[32]

Мазки крови фиксировались смесью Никифорова (этиловый спирт-безводный серный эфир в соотношении 1:1), окрашивались азур-эозином по Романовскому — Гимза. Дифференцированный подсчёт лейкоцитов производился четырехпольным методом под микроскопом Микромед-3 (Россия) и Olympus BH2-RFCA (Япония), применялись иммерсионные объективы (х100, х90), окуляры 7,5 и 10

[7][7]

Определение неферментных лизосомально-катионных белков осуществляли по В.Е. Пигаревскому и Н.А. Макаревичу

[15][19]

где N = ΣniMissing Mark : sub;

ni Missing Mark : sub— количество клеток с одинаковой интенсивностью окрашивания цитоплазмы.

Интенсивность окраски гранулоцитов оценивали полуколичественно:

0 — окраска отсутствуют;

0,5 — единичные гранулы, слабое окрашивание;

1,0 — бледно-зелёный цвет либо гранулы занимают примерно 1/3 цитоплазмы;

1,5 –цитоплазма окрашена равномерно в свет-ло-зеленый цвет;

2,0 — вся цитоплазма окрашена в зелёный цвет, имеются гранулы или участки с тёмно-зелёным цветом;

3,0 — вся цитоплазма тёмно-зелёного цвета.

Было произведено 145 определений активности неферментных лизосомально-катионных белков.

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли in vitro

[5]

Интегральная оценка выживаемости в баллах определялась согласно концепции иммунологических мобилей

[18][17]

Материалы исследования были подвергнуты математической обработке

[4][22]

Все расчёты выполнены в среде MathCAD 15.0. Исходные данные предварительно нормировались.

Исследование получило положительное заключение научно-технического совета Астраханского государственного технического университета (протокол № 1 от 28.01.2026).

3. Основные результаты

Изменение концентрации растворённого кислорода в воде при проведении эксперимента показано на рис. 1.

Активность рыб сохранялась вплоть до снижения концентрации кислорода до значения 2,4–2,5 мг/л. Они адекватно реагировали на тактильные раздражители и на звук при ударе по стенке аквариума. При дальнейшем понижении содержания кислорода в воде рыбы находились у поверхности воды, однако захватывать воздух они не могли, т.к. поверхность была закрыта во избежание газообмена с атмосферным воздухом. Затем они становились малоактивными. Среднее время выживаемости молоди бестера в опытном аквариуме при температуре воды 28°С составило 11 часов.

3.2. Математическая модель выживания рыб при функциональной нагрузке

В данном исследовании в качестве стресс-фактора был применена пониженная концентрация растворённого в воде кислорода. Критерием устойчивости рыб к фактору гипоксии служило время выживания, при этом гибель подопытных гидробионтов происходила не одномоментно. Соответственно, интервал времени от гибели первого экземпляра до достижения определённого эффекта (например, гибели половины подопытных животных) зависит от ряда факторов, в том числе и от физиологического состояния рыб. В данном контексте «ряд факторов» подразумевает модифицирующие факторы, которые при прочих равных условиях способны изменять устойчивость рыб к дефициту кислорода. Поскольку условия опыта подразумевали максимально однообразные показатели среды, модифицирующие факторы можно не учитывать. Таким образом, постулируется, что время выживания рыб в неблагоприятной среде в данном случае зависит только от их жизнестойкости. Кроме того, бескислородную среду можно рассматривать как агрессивную, поскольку она вызывает изменения в протекании физиологических процессов, что в конечном итоге находит своё выражение в смерти подопытных рыб.

Так как время жизни рыб в оптимальных условиях во много раз больше времени жизни в агрессивной среде, динамика численности

где

∞

Следует пояснить, что отмеченная выше «адаптация» может иметь достаточно длительный характер, если стресс-фактор умеренной интенсивности. Если же стресс-фактор имеет такие характеристики, что его интенсивность несовместима с жизнью рыб, то адаптация будет иметь кратковременный характер, и её срыв неизбежен. В данном случае критерием адаптации выступает эффективное время выживания.

Как уже отмечалось, определение физиологического состояния рыб перед опытом с функциональной нагрузкой осуществлялось по нескольким показателям. Соответственно числу рассмотренных параметров крови получаем систему из нескольких уравнений динамики численности групп рыб. Каждое из этих уравнений имеет решение вида

Здесь 0 начальное количество рыб k-ой группы;

∞0 постоянная, равная отношению числа адаптировавшихся особей к их первоначальному количеству;

t текущее время (в тех же единицах, что и эффективное время жизни [LATEX_FORMULA]\tau_k[/LATEX_FORMULA]).

Для оценки времени выживания группы рыб в бескислородной среде был применён метод наименьших квадратов в задаче о линейной регрессии.

Рассмотрим k-ю группу рыб. Запишем уравнение (3) математической модели в виде формулы (4):

Прологарифмировав левую и правую части этого равенства, получаем линейное уравнение (5):

где введено обозначение для функции, представляющей собой при ∞натуральный логарифм отношения числа живых рыб к их первоначальному количеству (6):

В данном эксперименте необходимо было по конечному числу (

Задача линейной регрессии состоит в восстановлении линейной зависимости по результатам измерений

Коэффициент линейной регрессии будет иметь вид (7):

Получаем связь коэффициента линейной функции со временем выживания данной группы рыб: [LATEX_FORMULA]a_{k}=-1 / \tau_{k}[/LATEX_FORMULA].

Отсюда, учитывая формулу (7), приходим к формуле для оценки эффективного времени выживания особей (8), относящихся к k-й группе по показателям крови:

Эта формула далее будет использована для оценки результатов эксперимента с функциональной нагрузкой.

3.4. Оценка резистентности бестера в зависимости от показателей активности неферментных лизосомально-катионных белков

Лизосомальные катионные белки (ЛКБ), которые локализованы в гранулоцитах крови, главным образом, в нейтрофилах, принимают участие в реализации неспецифической защиты от патогенов

[16], [29], [31]

Ранее была показана принципиальная возможность применения лизосомально-катионного теста для оценки жизнестойкости рыб при экстремальных условиях среды обитания

[1], [6]

Результаты опыта позволили разделить всех рыб, задействованных в эксперименте, на четыре группы (таблица 1).

Показанные в таблице группы были сформированы по выживаемости и по значению СЦК в лизосомально-катионном тесте. Первоначально мы планировали выделить три группы (с высокими показателями выживаемости при функциональной нагрузке, с низкими показателями и промежуточную), однако эксперимент показал, что низкая выживаемость была характерна для рыб как с низкими значениями СЦК, так и наоборот, с самыми высокими. Поэтому в конечном итоге было принято выделение четырёх групп рыб. Таким образом, было установлено, что наибольшей сопротивляемостью агрессивной среде, выраженной в виде времени выживания, характеризуются особи со средними значениями данного показателя, или немного выше средних.

3.5. Оценка зависимости резистентности бестера от показателей лейкоцитарного профиля крови (индекс Бредекка)

Индекс Бредекка (ИБ) рассчитывается как отношение числа лимфоцитов к палочкоядерным нейтрофилам. Может быть использован в виде интегрального показателя функционального состояния организма, увеличение значения ИБ свидетельствует о напряжённом состоянии неспецифической составляющей иммунитета [6], [13].

В нашем эксперименте была установлена разнокачественность рыб по показателю ИБ, при этом выделенные кластеры рыб обладали неодинаковой резистентностью к гипоксии (таблица 2).

Показано, что наибольшей устойчивостью к экспериментальной гипоксии обладали особи со значениями ИБ от 5,30 до 13,00.

3.6. Оценка зависимости резистентности бестера от показателей фагоцитарной активности нейтрофилов

Для характеристики клеточного иммунитета были рассмотрены такие показатели, как фагоцитарная активность нейтрофилов (ФАН) относительное количество нейтрофилов, которые проявили в эксперименте способность к фагоцитозу хотя бы одной корпускулярной частицы, и фагоцитарный индекс (ФИ) количество частиц, захваченных одним фагоцитом. Выживаемость рыб в зависимости от показателей фагоцитоза показана в таблице 3.

Таблица 3 демонстрирует, что наибольшую выживаемость в агрессивной среде (72,72% через 420 мин) демонстрируют рыбы с высокими показателями ФАН (53,45–75,35%) и ФИ (5,55–9,80). Группы с низкими значениями фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН < 48,15% / ФИ < 3,85) теряют всех особей уже к 420 мин., что подтверждает их низкую адаптивность.

3.7. Соответствие модели выживания рыб в агрессивной среде фактическим данным и верификация

Математическая модель, основанная на экспоненциальном убывании численности рыб, теоретически соответствует процессу выживания в условиях гипоксии, где вероятность гибели особи постоянна во времени в заданном временном интервале.

Верификация модели ограничена использованием метода наименьших квадратов для оценки параметра τk, т.к. в данной работе авторы не применяют модель для получения прогнозируемых значений, а ограничиваются оценкой экспериментальных данных. В качестве примера приводятся расчетные значения эффективного времени жизни для разных групп рыб по значениям ИБ (таблица 4), при этом следует вновь подчеркнуть, что формула (8) является ключевой для оценки эффективного времени жизни и выводится из линеаризованной экспоненциальной модели.

Расчётные значения τkMissing Mark : sub позволили количественно оценить устойчивость групп рыб к гипоксии. Например, для группы с максимальным τkMissing Mark : sub= 657,5 мин (табл. 4) подтверждена высокая корреляция между показателями крови (ИБ) и выживаемостью (rsMissing Mark : sub=0,89, p<0,01).

Для оценки адаптационных возможностей рыб при выживании в неблагоприятных условиях (гипоксия) была принята балльная оценка, показанная в таблице 5.

Были, прежде всего, выделены группы особей с лучшими и худшими показателями выживаемости в агрессивной среде. Наименее устойчивыми оказались особи со сниженными показателями неспецифической резистентности. Наибольшую выживаемость продемонстрировали рыбы с показателями ЛКТ от 1,25 до 1,80, ФАН от 53,45 до 75,35 и ИБ от 5,30 до 13,00.

Результаты экспериментов побудили нас выделить две группы рыб с промежуточными показателями выживаемости. В этих группах были рыбы как с повышенными значениями рассмотренных гематологических показателей, так и с приближающимися к наименьшим. Несколько более устойчивыми оказались рыбы, у которых большинство показателей значительно превышали средние. Само по себе повышение реактивности следует рассматривать как благоприятный прогностический признак, однако в этот период организм остается чувствительным к воздействию неблагоприятных условий. Такая рыба может считаться условно здоровой. При обитании в благоприятных условиях, либо после проведения оздоровительно-профилактических мероприятий можно рассчитывать на увеличение её жизнестойкости [11].

4. Обсуждение

В своем исследовании мы придерживались основополагающего принципа, сформулированного ещё В.И. Лукьяненко [14], который показал, что проблема стандарта заводской молоди осетровых, ее жизнестойкости может быть решена только с позиций и методами физиологии. При этом под «качеством» заводской молоди осетровых следует понимать степень ее жизнестойкости, т.е. устойчивости к разнообразным факторам внешней среды абиотической и биотической природы.

Но подход к выбору показателей у нас принципиально отличается, и вот почему. При разработке стандарта заводской молоди целью было найти такой момент в жизни мальков рыб, когда они обладают наибольшей способностью приспосабливаться к изменяющимся условиям их жизни при выпуске из прудов в реку или же при их вывозе на места нагула в море. При этом еще учитывалось то обстоятельство, что передержка молоди в прудах ведет к истощению кормовой базы, что отрицательно сказывается на жизнестойкости рыб.

Однако специфика товарного выращивания заключается, в частности, и в том, что рыба находится в искусственных условиях постоянно, поэтому есть необходимость оценки качества рыбы, ее адаптационного потенциала в любой момент времени.

Вообще надо сказать, что способность рыбы адаптироваться и, следовательно, выживать, зависит от того, насколько нормально функционируют основные гомеостатические системы (нервная, эндокринная, иммунная). Мы в наших исследованиях сделали упор на связанные с иммунной системой клеточные показатели. Исторически понятие резистентности нередко отождествляется с понятием естественного иммунитета, хотя в физиологическом плане оно шире, т.к. резистентность проявляется, прежде всего, в форме общей устойчивости организма, а не только как действие против живых агентов. Общая или неспецифическая резистентность относится к числу интегральных функциональных характеристик организма и являющаяся показателем его устойчивости к различным воздействиям. В живом организме иммунологические и неспецифические защитные реакции практически всегда протекают сочетанно и взаимосвязаны по существу.

В наших исследованиях мы применяли автоконтроль. Рыбы делились на кластеры в зависимости от значения иммунофизиологических показателей. Для проверки корректности такого подхода и были поставлены опыты с функциональной нагрузкой.

Очевидно, что устойчивость рыб к гипоксии и температуре воды выше оптимальных значений непосредственно не связана с функциями иммунной и связанных с последней системами. Тем не менее, выбор рассмотренных выше показателей был предопределён рядом соображений. Во-первых, гематологический анализ позволяет производить манипуляции с рыбой, оставляя их живыми, что особенно важно при работе с такими ценными рыбами, как осетровые. Во-вторых, многолетняя лабораторная практика в различных отраслях (медицина, ветеринария, рыбоводство) позволяет утверждать, что количественные и качественные показатели крови имеют значение в диагностике самых разнообразных состояний [1], [5], [13].

Следует подчеркнуть, что использование гематологических показателей (ИБ, СЦК, ФАН) в качестве предикторов выживаемости является нетрадиционным для аквакультуры осетровых, хотя сама экспоненциальная модель – общепринятый инструмент. Так, в частности, экспоненциальная модель (2) известный метод в популяционной динамике для описания смертности под воздействием стрессоров [3], [20]. Однако наша модель имеет некоторые отличия, в частности, для корректного описания динамики любой популяции, как животных, так и растений, учитывается как смертность, так и пополнение (рождаемость), в нашем исследовании рассматривали только смертность в крайне ограниченном временном интервале. Кроме того, мы не ставили своей целью получить некую модель, которая бы описывала выживаемость рыб при гипоксии, наша модель была призвана показать, что выбранные гематологические показатели могут достоверно отражать способность молоди бестера выживать в условиях агрессивной среды, т.е. свидетельствовать о «качестве молоди бестера».

Рассматриваемая модель предполагает постоянную интенсивность смертности, что может не учитывать, например, накопление различных стрессовых факторов и их аддитивное или синергетическое воздействие на рыб, а также нестационарный характер влияния фактора, например изменение со временем и/или влияние индивидуальных различий внутри групп. Значительную роль в этом процессе играют физиологическое состояние рыб, их возраст, масса тела, уровень метаболической активности, а также параметры водной среды, включая температуру, химический состав и уровень загрязнения. Поэтому перспективным направлением развития данного исследования может быть построение многофакторной модели, поскольку однофакторные агрессивные воздействия, как в природе, так и в аквакультуре, являются скорее исключением, в то время как многофакторные правилом [9].

5. Заключение

В основе интегральной оценки качества рыб (бестера) лежит положение, что одинаковые состояния устойчивости к неблагоприятным факторам среды может обеспечиваться разными механизмами, недостаточность одного защитного фактора компенсируется другими. Математическое моделирование и численный анализ данных эксперимента по выживанию молоди бестера в опыте с функциональной нагрузкой позволяет подтвердить указанное положение.

Новизна работы заключается в адаптации традиционных математических методов к анализу гематологических показателей рыб для оценки их связи с выживаемостью. Такой синтез биологических и математических подходов в контексте аквакультуры осетровых может считаться оригинальным, хотя сама модель не является принципиально новой. Подход сочетает общепринятые методы с инновационным приложением к задачам аквакультуры, что повышает его практическую ценность.

Выводы:

1. Результаты эксперимента в целом согласуются с предложенной математической моделью динамики численности рыб.

2. Рассчитываемое по опытным данным эффективное время жизни является количественным параметром, характеризующим устойчивость к агрессивной среде группы особей с определенными значениями индекса Бредекка.

3. Рассчитанные по данным эксперимента эффективные времена жизни по выбранным показателям крови оказались довольно близкими по значению.

The additional file for this article can be found as follows: