1. Введение
Коллагеназа — протеолитический фермент, расщепляющий нативные коллагеновые волокна
[1][2][3][4][5][6][7][8]
Цель работы — комплексное изучение влияния различных методов предварительного замораживания на ход процесса лиофилизации и конечную ферментативную активность коллагеназы, а также определение оптимальных параметров процесса для максимального сохранения активности фермента.
2. Методы и принципы исследования
Фермент: Коллагеназа типа I (производитель: Sigma-Aldrich, США).
Буферные системы: Компоненты специально разработанной оптимизированной стабилизирующей буферной системы (pH 7,4) для лиофилизации коллагеназы.
Субстрат для анализа активности: Высокоочищенный желатин.
Реактивы для анализа влажности: Реактивы для кулонометрического титрования по Карлу Фишеру (ОФС.1.2.3.0002.15 Определение воды. Государственная фармакопея Российской Федерации XIV, вып. 1)
Оборудование: Спектрофотометр, Лиофильная сушка.
Расходные материалы: Стеклянные флаконы типа 2R, резиновые пробки, алюминиевые колпачки.
Состав буфера подобран для обеспечения максимальной стабильности фермента в процессе лиофилизации. Рабочий раствор коллагеназы типа I (Sigma-Aldrich, США) растворяли в оптимизированной буферной системе (pH 7,4) до концентрации 5 мг/мл. По 0,5 мл полученного раствора разливали в стеклянные флаконы типа 2R.
Параметры лиофилизации коллагеназы
| Этап процесса | Параметры |
| 1. Подготовка образца | |
| Фермент | Коллагеназа типа I (Sigma-Aldrich) |
| Концентрация | 5 мг/мл в сформированном составе |
| Объем на флакон | 0,5 мл |
| Тип флакона | Флаконы 2R |
| 2. Предварительное замораживание | |
| Метод 1 | −20°C (медленное замораживание) |
| Метод 2 | −80°C (быстрое замораживание) |
| Метод 3 | Жидкий азот (−196°C, ультрабыстрое замораживание) |
| Метод 4 (рис 1) | Контролируемое замораживание в камере лиофилизатора со скоростью охлаждения 1°C/мин до -50°C |
| 3. Первичная сушка (сублимация) | |
| Температура | −15°C |
| Давление | 0,10 мбар |
| Время | 24 часа |
| 4. Вторичная сушка (десорбция) | |
| Температура | +25°C |
| Давление | 0,05 мбар |
| Время | 6 часов |
Процесс лиофилизации с графиком с использованием предварительного замораживание по методу 4
Остаточную влажность лиофилизированных образцов определяли кулонометрическим титрованием по Карлу Фишеру в соответствии с методикой, описанной в Государственной Фармакопее Российской Федерации (ГФ РФ XIV издание, общая фармакопейная статья ОФС.1.2.3.0002.15 «Определение воды»). Измерения проводили в трех повторностях для каждого варианта лиофилизации.
Ферментативную активность нативной и лиофилизированной коллагеназы оценивали спектрофотометрически по скорости гидролиза высокоочищенного желатина. Использовали модифицированный метод, основанный на измерении оптической плотности (ОП) продуктов реакции при длине волны 595 нм.
[9][10]
Активность рассчитывали по изменению ОП в единицу времени и выражали в процентах относительно активности нативного (не лиофилизированного) фермента, принятой за 100%. Измерения проводили в трех биологических повторностях.
3. Основные результаты
Результаты по четырем протоколам лиофилизации представлены в таблице 2 и наглядно на рисунке 2 и 3.
Полученные результаты
| Метод замораживания | Активность, % | Остаточная влажность, % |
| Метод 1 | Коллапс структуры | Высокая (более 10) |
| Метод 2 | Средняя (70-85) | Средняя (3-6) |
| Метод 3 | Средняя (50-75) | Высокая (5-10 и более) |
| Метод 4 | Высокая (>85-95) | Низкая (1-3) |
График активности коллагеназы
График остаточной влажности
Полученные результаты демонстрируют выраженную зависимость как сохранения активности коллагеназы, так и эффективности удаления влаги от выбранного режима предварительного замораживания.
1. Метод 1 (Медленное замораживание при -20°C): привел к катастрофической потере активности (<10%) и образованию лиофилизата с высокой остаточной влажностью (>10%). Визуально наблюдался полный коллапс структуры [11], плавление и образование липкого осадка.
2. Метод 2 (Быстрое замораживание при -80°C): позволил сохранить значительную часть активности (70–85%) при остаточной влажности 3–6%. Наблюдалось незначительное сморщивание структуры. Быстрое замораживание приводит к образованию более мелких кристаллов, что снижает механическое повреждение [12], [13]. Однако неравномерность охлаждения в морозильной камере, вероятно, не обеспечила идеальной структуры льда по всему объему образца.
3. Метод 3 (Ультрабыстрое замораживание в жидком азоте, -196°C): неожиданно показал наихудшие результаты после медленного замораживания по активности (50–75%) и влажности (5-10%). Визуально отмечалось сильное растрескивание и хрупкость торта, возможны следы плавления.
4. Метод 4 (Контролируемое замораживание в лиофилизаторе, 1°C/мин до -50°C): продемонстрировал наилучшие результаты. Сохранение активности составило 85–95% (в среднем около 90%), остаточная влажность была минимальной (1–3%). Лиофилизат имел ровную, пористую структуру без признаков коллапса или растрескивания. Контролируемое, медленное и равномерное понижение температуры обеспечило формирование крупной, но правильной кристаллической структуры льда. Такая структура создает оптимальные каналы для выхода водяного пара во время первичной сушки, способствуя эффективной сублимации и формированию стабильного, высокопористого каркаса. Это минимизирует стресс для белка и позволяет достичь глубокой сушки на этапе десорбции.
4. Обсуждение
Результаты однозначно указывают на критическую важность этапа предварительного замораживания для успешной лиофилизации коллагеназы. Полученные данные согласуются с общепринятыми представлениями в технологии лиофилизации: медленное замораживание приводит к коллапсу и потере активности, сверхбыстрое замораживание в массивных образцах часто неэффективно из-за неравномерности процесса. Оптимальным для данного препарата оказалось контролируемое замораживание со скоростью 1°C/мин до температуры -50°C, проводимое непосредственно в камере лиофилизатора. Этот режим обеспечил формирование оптимальной ледяной субстанции, что позволило провести эффективную сублимацию (первичную сушку) при -15°C и глубокую десорбционную сушку при +25°C без структурного разрушения «торта». Как следствие, была достигнута максимальная сохранность ферментативной активности (до 90-95%) и минимальная остаточная влажность (1–3%), что является ключевым для долгосрочной стабильности препарата.
5. Заключение
Проведенные исследования подтвердили гипотезу о существенном влиянии режима предварительного замораживания на эффективность лиофилизации и сохранение активности коллагеназы. Установлено, что:
Медленное (-20°C) и ультрабыстрое (жидкий азот) замораживание являются неоптимальными, приводя к значительной потере активности (менее 10% и 50–75% соответственно) и повышенной остаточной влажности (>10% и 5–10%).
Быстрое замораживание (-80°C) позволяет сохранить приемлемую активность (70–85%) при влажности 3–6%.
Контролируемое замораживание со скоростью 1°C/мин до -50°C в камере лиофилизатора является оптимальным методом для данного препарата коллагеназы, обеспечивая сохранение 85–95% исходной ферментативной активности и остаточную влажность на уровне 1–3%. Полученные результаты имеют важное практическое значение для разработки стабильных лекарственных форм и биотехнологических препаратов на основе коллагеназы. Рекомендованный режим замораживания может быть использован в технологических регламентах производства.