1. Введение
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) — одно из наиболее летальных онкологических заболеваний, характеризующееся крайне низкой пятилетней выживаемостью (5–7%)
[1][2][3][4][5][6]
В данном исследовании на основе секвенирования 16S рРНК проведен сравнительный анализ интратуморального микробиома протоковой аденокарциномы поджелудочной железы с целью выявления бактериальных сообществ, ассоциированных с различной степенью дифференцировки опухоли. Полученные данные имеют потенциальную ценность для разработки новых диагностических и прогностических подходов.
2. Методы и принципы исследования
Собрана коллекция образцов опухолевых FFPE тканей от пациентов с аденокарциномой поджелудочной железы на базе института хирургии им. Вишневского. Все материалы были собраны и охарактеризованы патологоанатомическим отделением организации в соответствии с WHO classification of tumors of the pancreas
[7]
Клинические и патологические характеристики пациентов с PDAC
| Характеристика | Количество, n |
| Общее количество пациентов | 28 |
| Пол | |
| женский | 14 |
| мужской | 14 |
| Grade | |
| G1 | 4 |
| G2 | 12 |
| G3 | 12 |
При помощи набора ExtractDNA FFPE (Evrogen, Россия) с адаптациями (увеличение времени инкубации на 56 градусах до 24 часов) выделена тотальная ДНК из FFPE образцов опухолей. Контроль включает в себя следующие образцы: куски парафина с исходных парафиновых блоков, мазки с рабочих инструментов и поверхностей в институте хирургии им. Вишневского, мазки с рабочих инструментов и поверхностей в лаборатории, контроль выделения ДНК, контроль подготовки библиотек. ДНК из мазков выделялась набором ДНК-сорб Б (Amplisens, Россия). Проведена качественная и количественная оценка выделенных образцов на приборе Nano Drop 1000 и Qubit 4 (Invitrogen, США), соответственно.
Чтобы обеспечить более высокую точность определения таксонов в деградированных образцах с малой микробной биомассой использовался мультиплексированный 16S протокол секвенирования рДНК, который поднимает пять 16S коротких областей (V2, V3, V5, V6, V8), чтобы увеличить охват и разрешение обнаружения видов бактерий (длина фрагментов 250-400 bp). При помощи MULTIPLEX TCR PCR Mix (МайЛаборатори, Россия) выполнена подготовка ампликонных библиотек со специальными мультиплексными праймерами. По 0.2µM каждого праймера на реакцию:
F1-TGGCGAACGGGTGAGTAA,
F2- ACTCCTACGGGAGGCAGC,
F3-GTGTAGCGGTGRAATGCG
F4-GGAGCATGTGGWTTAATTCGA,
F5-GGAGGAAGGTGGGGATGAC,
R1-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGTGTCTCAGTCCCARTG,
R2-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTATTACCGCGGCTGCTG,
R3-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCGTCAATTCMTTTGAGTT,
R4-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGTTGCGGGACTTAACCC,
R5-AGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGGCCCGGGAACGTATT.
Для поднятия коротких последовательностей 5R участка бактериальной рРНК, индексирование производилось специфическими индексами. По 0.2µM каждого праймера:
FF1-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGCAACGGGTGAGTAA,
FF2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTCCTACGGGAGGCAGC,
FF3-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGTAGCGGTGRAATGCG,
FF4-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGCATGTGGWTTAATTCGA,
FF5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAGGAAGGTGGGGATGAC.
И один баркодспецифичный 8 нуклеотидный обратный праймер (0.4µM, RR5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNN-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT). Концентрация готовых библиотек измерена на приборе Qubit 4 (Invitrogen, США) с использованием набора Qdye HS для определения количества двуцепочечной ДНК (Lumiprobe, Россия). Библиотеки смешаны эквимолярно в пул, качество библиотек проверено на приборе Qsep 1 Plus (Qsep, Тайвань). Секвенирование библиотек произведено на приборе MiSeq (Illumina, США) в режиме парно-концевых прочтений (150×2) с использованием набора MiSeq Reagent Kit v2 (300 cycles).
Полученные прочтения вычислительно объединены в длинные ампликоны с использованием Short MUltiple Regions Framework (SMURF) и базы данных Greengenes. Чтобы улучшить таксономическое назначение, использовался классификатор рибосомальной базы данных (RDP). Относительная численность преобразована в количество прочтений путем умножения на общее количество прочтений. Прочтения образцов нормализованы в каждой библиотеке секвенирования с помощью коэффициента, представляющего отношение среднего количества прочтений образца в конкретной библиотеке к общему среднему значению по библиотекам. Образцы с менее чем 1000 нормализованными прочтениями (включая отрицательный контроль) и виды с относительной численностью менее 10-4Missing Mark : sup исключены из дальнейшего анализа.
Полученные данные пропустили через серию из 5 фильтров для обнаружения и удаления загрязнения:
– Фильтр 1
—
– Фильтры 2–4
—
– Фильтр 5: сравнение распространенности таксонов во всех образцах для каждого состояния с их распространенностью в наборе пустых контрольных парафиновых блоков.
Показатели альфа и бета разнообразия выборки (энтропия Шеннона, индекс преобладания Бергера–Паркера, прямой и обратный индексы Симпсона, индекс Джини–Симпсона, индекс Chao1, индекс Брея-Кертиса и Жаккара) были получены с использованием пакета vegan package (v2.5.6) (OKSANEN J. vegan: Community EcologyPackage. R package version 2.0-2 //http://CRAN. R-project. org/package= vegan. – 2011.). Для определения «повышенного содержания» таксонов в группах G1-G3 использовался програмный пакет ANCOM-BC и выбирались таксоны, с |logFC| > 1 и q-value (поправка Бенджамини-Хохберга) < 0.05. Статистическая значимость в альфа-разнообразии была оценена тестами ANNOVA и Kruskal-Wallis c пороговым значением p < 0.05.
3. Основные результаты
Собрана и охарактеризована выборка из FFPE образцов PDAC (табл. 1). Из первоначальных 29 образцов FFPE, подвергнутых анализу микробиома 16S, 28 были признаны пригодными для дальнейшего последующего анализа. Один из образцов был исключен из-за наличия считываний митохондриальной последовательности. В составе выборки представлены высокодифференцированные опухоли от 4 пациентов, умеренно дифференцированные
—
Получены данные секвенирования нескольких типов отрицательного контроля: образцы с разных поверхностей и оборудования в лабораториях патологической анатомии и молекулярной генетики, 159 парафиновых контролей (парафиновые области без ткани) и контроль с этапов выделения ДНК (пустые), ПЦР и очистки (без шаблона). Эти данные были объединены в негативный контроль. Выявленные семейства бактерий и их относительное обилие в отрицательных контролях показаны на рисунке 1. Вклад контаминации очень высок. Основные контаминанты — бактерии семейств Moraxellaceae, Microbacteriaceae, Enterobacteriaceae, Propionibacteriaceae, Deinococcaceae, Gordoniaceae.
Относительное распределение бактериальных семейств в контроле
При анализе относительного содержания бактерий на уровне семейства идентифицировано присутствие семейств в G1 опухолях:
Относительное содержание бактерий при PDAC по степени дифференцировки на уровне семейства
Также удалось идентифицировать микробный состав в опухоли до вида (рис. 3). Для низкодифференцированных опухолей было характерно повышенное содержание таких видов как
—
Относительное содержание бактерий при PDAC по степени дифференцировки на уровне вида
Эти метрики глобальны и устойчивы к изменениям в отдельных таксонах. Отсутствие значимых различий означает, что общая структура, «география» сообществ и их внутреннее богатство в среднем схожи между группами. Дифференциальный анализ (ANCOM-BC) работает на уровне отдельных таксонов. Он выявил тонкие, но статистически значимые сдвиги в содержании конкретных бактерий, которые могут быть размыты при взгляде на все сообщество.
Оценка альфа-разнообразия
Для оценки бета-разнообразия мы провели анализ главных координат (PCoA) на основе расстояний различия Брея–Кертиса, который визуализирует различия в составе микробного сообщества. Графики PCoA не выявили значительной кластеризации среди образцов, что свидетельствует о минимальной дифференциации микробного состава между опухолями с различной гистологической градацией (рис. 5).
График PCoA, демонстрирующий структуру микробного сообщества
4. Обсуждение
Рак поджелудочной железы представляет собой одну из самых сложных проблем современной онкологии, а его микробное наполнение — возможно, самый неожиданный и перспективный ключ к ее решению. Когда речь заходит о факторах, определяющих агрессивность PDAC, традиционно рассматриваются генетические мутации (например, в гене
[8][9][10][11][12][13][14][15][16][17]
Так,
[18][19][20]
Кроме того,
[18][21][22]
Для G2 опухолей характерно присутствие бактерий семейства
[23][24]
В опухолях G2 наблюдается повышенное содержание
[25][26][23]
[27][28][29]
Увеличение количества
[30][32][33][35][36][37][38]
[39]
Данное исследование имеет ограничения, на текущий момент, исследование не позволяет оценить диагностическую точность, полученных бактериальных сигнатур, это требует независимой валидации в проспективных когортах с большим размером выборки. Размер выборки в этом исследовании слишком мал, чтобы сделать более убедительный вывод. Исключение таксонов, обнаруженных в контрольных образцах, также может иметь ограничения, поскольку широко распространенные бактерии могут присутствовать как в контрольном, так и в исследуемом образце, не подвергаясь загрязнению в результате работы с образцом. Кроме того, поскольку забор микробов проводился из отдельных участков опухоли, они могут не отражать всего микробного разнообразия опухоли.
5. Заключение
Выявление специфических бактериальных таксонов, ассоциированных с гистологическими типами опухоли, открывает перспективы для изучения их взаимодействия с клетками PDAC и их регуляции. Нам удалось идентифицировать уникальный микробиомный профиль для опухолей разной степени дифференцировки, и установить, что каждое бактериальное сообщество может вносить свой вклад в формирование особых метаболических и иммунных микросред, характерных для опухолей различной степени агрессивности. В качестве следующего шага мы планируем валидацию этих ассоциаций, что является необходимым условием для последующего изучения причинно-следственных механизмов и оценки потенциала микробиомных маркеров для клинического применения. Это сформирует основу для создания новых диагностических, прогностических и терапевтических стратегий.