1. Введение

В условиях глобального изменения климата тепловой стресс становится серьёзной проблемой для лесных экосистем, ограничивая рост, выживаемость и размножение древесных пород. Растения выработали сложные регуляторные механизмы, позволяющие своевременно реагировать на внешние стрессовые факторы, чтобы обеспечить оптимальный рост и устойчивость к стрессу. Среди них — гормональные сигнальные пути и стресс-индуцируемые транскрипционные факторы, которые образуют взаимосвязанную систему реакций. На водный дефицит в растениях запускаются сложные каскады молекулярно-генетических реакций, направленные на поддержание клеточного гомеостаза и защиту органелл от окислительного стресса [1], [2].

Один из механизмов адаптации к неблагоприятным факторам внешней среды реализуется за счет факторов транскрипции семейства DREB и компонентов ауксинового сигнального пути, взаимодействие которых определяет баланс между стрессовой устойчивостью и темпами вегетативного роста [3]. При засухе факторы DREB, принадлежащие к подсемейству AP2/ERF, распознают консервативные элементы DRE/CRT в промоторах генов раннего ответа, координируют экспрессию защитных белков [4]. Активность факторов транскрипции DREB, в особенности DREB2A, в значительной степени зависит от посттрансляционными механизмов. В нормальных условиях белок DREB2A быстро деградирует через убиквитин-протеасомный путь посредством фосфорилирования негативного регуляторного домена (NRD) и дальнейшего убиквитинирования E3-лигазами DRIP1/DRIP2. При развитии водного дефицита эти процессы ослабляются, в результате чего повышается стабильность DREB2A и усиливается транскрипция генов-мишеней. Для долгоживущих долгоживущих древесных растений в условиях постоянного стресса этот механизм особенно значим для обеспечения быстрого включения защитных программ [3]. Одновременно с этим ауксин-зависимые гены (такие как Aux/IAA и ARF) выступают посредниками в перераспределении ресурсов, часто подавляя ростовые процессы в пользу адаптации, что делает их анализ необходимым для понимания многоуровневого ответа на засуху [5].

Для выявления иерархической структуры этих взаимодействий в современной биоинформатике активно применяются методы анализа взвешенных сетей совместной экспрессии генов (WGCNA), позволяющие группировать гены в функциональные модули [6]. С помощью программных комплексов визуализации, таких как ggraph (R) и iTOL, становится возможным выделение ключевых «узлов» или хаб-генов, обладающих наибольшим количеством регуляторных связей в системе [7]. Такой системный подход позволяет перейти от анализа отдельных генов к пониманию работы целых регуляторных программ.

Дуб черешчатый (Quercus robur L.) является основой лесообразующей пород, используемой в агролесомелиорации и защитном лесоразведении на территориях с засушливым климатом. Однако, несмотря на наличие авторматически аннотированного генома, многие гены, вовлеченные в процесс адаптации к неблагоприятным факторам идентифицированы частично и отсутствует информация об их молекулярных путях взаимодействия друг с другом [8].

В связи с вышесказанным целью данной работы стало проведение идентификации генов DREB и Aux/IAA в геноме Q. robur и выявление среди них центральных регуляторов засухоустойчивости методом сетевого анализа.

2. Методы и принципы исследования

2.1. Идентификация и характеристика DREB- и ауксин-зависимых генов у Q. robur

Аминокислотные последовательности белков были получены из информационных базы данных NCBI. Референсом служил геном Q. robur v3.1 (GCF_932294415.1) с аннотацией из базы Genome NCBI. Чтобы идентифицировать все потенциальные последовательности DREB и ауксин-зависимых генов у Q. robur, мы выполнили поиск HMMER v3.3.2 [9] с использованием скрытых марковских моделей (HMM) для консервативных доменов AP2 (PF00847) и Auxin_resp (PF02309) из базы Pfam [10] против последовательностей всего генома. Значение e больше 1e-5 или длина последовательности меньше 70 аминокислот использовались в качестве критерия скрининга для фильтрации последовательностей. Для оценки консервативности функционально значимых участков белков и выявления мотивов, характерных для исследуемых семейств, дополнительно применяли анализ MEME v5.5.3 [11].

2.2. Классификация семейств генов и их хромосомная локализация

Локализация генов изученных семейств в хромосомах была получена из аннотации генома Q. robur. Визуализация хромосомного распределения выполнена с использованием пакетов ggplot2 [12] и patchwork в среде R v4.x. Идиограмма хромосом построена на основе размеров хромосом референсного генома v3.1 (GCF_932294415.1).

2.3. Анализ распределения мотивов в Q. robur

Консервативные мотивы в аминокислотных последовательностях изучаемых белков были идентифицированы с использованием MEME v5.5.3 со следующими параметрами: максимальное количество мотивов — 20, с нулевым или одним появлением на последовательность [11].

2.4. Растительный материал, экстракция РНК, получение данных секвенирования и анализ экспрессии генов

В ранее проведенном эксперименте [13] сеянцы Q. robur. были разделены на три группы: контрольную (начало эксперимента), полив и засуха через 2 недели после начала эксперимента. Для данной работы были взяты 3-и образца РНК растений, , полученных в ходе пилотных исследований (SRA: SRX27185000, SRX27185001, SRX27185002; BioProject: PRJNA1202660).

Количественная оценка транскрипционной активности генов проводилась путём подсчёта числа прочтений на ген с помощью samtools bedcov с последующей нормализацией данных методом подсчета прочтений на миллион (CPM). После получения данных секвенирования транскриптома Q. robur в условиях засухи, были проведены скрининги дифференциально экспрессируемых генов с помощью веб-сервиса Galaxy (https://usegalaxy.eu/). Инструмент HISAT2 [14] использовался для картирования прочтений на референсный геном. Для подсчета количества прочтений генов использовалась программа featureCounts [15]. Анализ дифференциальной экспрессии проводился с применением статистического пакета edgeR. В связи с отсутствием биологических повторностей дисперсию невозможно было измерить, поэтому коэффициент вариации был задан вручную и равен BCV = 0,4. Данное значение рекомендовано руководством edgeR для аутбредных организмов и полевых образцов с высокой биологической изменчивостью [16]. Гены считались дифференциально экспрессируемыми при соблюдении пороговых значений FDR < 0.08 и |log2FC| > 1. Визуализация результатов выполнялась с использованием инструментов heatmap2 и ggplot2.

2.5. Построение сети ко-экспрессии

Сеть ко-экспрессии построена на основе коэффициента корреляции Пирсона между профилями экспрессии генов в условиях засухи, полива и контроля. Пороговое значение корреляции r > 0,99 применено для фильтрации слабых связей и выделения наиболее функционально значимых взаимодействий. Выбор данного порога отбора обусловлен малым количеством образцов в выборке, поэтому в пилотном исследовании только связи с высоким уровнем корреляции можно считать достоверными. Пары генов с корреляцией выше установленного порога соединялись ребром. Хаб-гены определены как узлы с числом связей (degree) ≥ 8, что соответствует верхнему квартилю распределения связности в сети. Визуализация сети выполнена с использованием пакетов ggraph и igraph в среде R с применением алгоритма раскладки Fruchterman-Reingold.

2.6. Иерархическая кластеризация и филогенетическая визуализация

Иерархическая кластеризация генов выполнена методом Уорда (Ward.D2) на основе евклидова расстояния между log₂-трансформированными значениями экспрессии. Круговая дендрограмма ко-экспрессии построена с использованием веб-сервиса Interactive Tree Of Life (iTOL v6, itol.embl.de/) [7]. Дерево экспортировано в формате Newick и загружено в iTOL, где выполнена аннотация: цветовые полосы семейств генов, маркировка хаб-генов и визуализация межмодульных связей.

3. Основные результаты

3.1. Идентификация и структурная характеристика генов семейств DREB и ауксинового сигналинга

Биоинформатический анализ генома Q. robur с использованием скрытых марковских моделей для доменов AP2/ERF и Auxin_resp позволил выявить 72 гена семейства DREB и 36 генов ауксинового сигнального пути. Анализ их локализации показал неравномерную и высокую степень кластеризации в конкретных локусах (рис. 1). Наибольшее число генов DREB выявлено на первой (n = 17) и четвёртой (n = 11) хромосоме. Гены Aux/IAA же распределены более равномерно с незначительным увеличением числа на 8 хромосоме (n = 7) и на 9 хромосоме (n = 7).

Анализ консервативных мотивов с помощью MEME подтвердил структурную архитектуру белков и их принадлежность к семействам DREB и Aux/IAA. У DREB идентифицирован высококонсервативный ДНК-связывающий домен AP2/ERF (Motif 1, p-value = 2,19×10⁻⁶³) с консенсусной последовательностью PKRVAGRKKFRETRHPVYRGVRRRGNAGRWEVREVRDHNKKRIWLGTFPT. Он содержит сигнал ядерной локализации (мотив KRV-A-GR), участок контакта с ДНК (KKFRET) и определяющий WLG-мотив подсемейства DREB/CBF. Доменная архитектура хаб-белков LOC126708900, LOC126705463 и LOC126700339 содержит консервативную организацию с идентичным расположением функциональных модулей, что указывает на их общее эволюционное происхождение и функциональную эквивалентность в стрессовом ответе (рис.2).

В свою очередь, в группе белков ауксинового сигналинга локализованы два ключевых структурных модуля домена Auxin_resp. Первый модуль (Motif 1, p-value = 9,70×10⁻³⁶) с консенсусом GRVYNVYDREGKLGVAENLSYVIEAKLPLSPSSSFDFSSP структурно соответствует PB1-подобному интерфейсу связывания с факторами ARF и содержит серин-богатый участок (потенциальные сайты фосфорилирования). Второй модуль (Motif 2, p-value = 2,21×10⁻³³) с консенсусом RNRSYHLVYELLDGSLYVYAESLREKGLP включает канонический мотив GDGSL интерфейса димеризации. Высокая степень консервативности доменной архитектуры у всех пяти хаб-белков Aux/IAA (LOC126725348, LOC126710403, LOC126717446, LOC126710489, LOC126703153) с общими значениями p-value < 10⁻⁹³ подтверждает их способность функционировать в качестве транскрипционных репрессоров, блокирующих активность факторов ARF путем прямого физического взаимодействия (рис.3).

3.2. Дифференциальная экспрессия генов в условиях засухи

Анализ транскриптома Q. robur в условиях моделируемой засухи показал значительные изменения в экспрессии идентифицированных генов (рис.4). После фильтрации по уровню экспрессии (CPM > 1 хотя бы в двух образцах для дальнейшего анализа) отобрано 42 гена DREB и 36 генов ауксинового сигналинга. При построении сети ко-экспрессии с порогом r > 0,99 в сеть вошли 23 гена DREB и 34 гена ауксинового сигналинга, формирующих 169 функциональных связей. При пороговых значениях FDR < 0,08 и |log₂FC| > 1 для 23 генов наблюдалось статистически значимое изменение уровня транскрипции. Большинство генов сети относились к категории репрессированных.

Сравнение показателей дифференциальной экспрессии выявило лидирующие гены в каждой из исследуемых групп (Таблица 1). В семействе DREB самую высокую активность имеет ген LOC126710507 во всех режимах полива. Однако, хаб-гены LOC126700339 и LOC126700341 входят в число наиболее активных транскриптов при поливе. В семействе Aux/IAA было отмечено изменение уровня транскрипции конкретных генов в ответ на засуху. В контрольных образцах мажорным транскриптом был LOC126710489, а при засухе ген LOC126717446, который продемонстрировал максимальные значения по уровню экспрессии среди всех членов семейства. Максимальную же экспрессию выявил ген LOC126717446. При этом было обнаружено, что основной регуляторный узел семейства-хаб-ген LOC126725348 подвергается значимой репрессии (log2FC = -1,78; FDR <0,05).

Визуализация результатов в формате Volcano plot (рис. 4) позволила идентифицировать ключевые регуляторные гены. Наиболее выраженную репрессию показал ген LOC126710403 (log₂FC = −2,5; −log₁₀P > 10), функционально аннотированный как регуляторный белок. Данный ген располагается в области пересечения модулей DREB и Auxin на сети ко-экспрессии.

Анализ тепловых карт экспрессии, показал видимые различия между подсемействами DREB/CBF и Aux/IAA и ARF(AP2/ERF) в условиях засухи, полива и контроля (рис. 5). В ходе анализа дифференциальной экспрессии представителей DREB-зависимых генов было выявлено 3 блока, где наглядно продемонстрированы различия в транскрипционной активности в зависимости от условий. Схожая картина наблюдалась и у представителей ауксин-зависимых генов.

3.3. Построение и анализ сети ко-экспрессии

Для выявления функциональных взаимодействий между генами DREB и ауксинового сигналинга была построена взвешенная сеть ко-экспрессии на основе коэффициента корреляции Пирсона (рис. 6). Топология которой выявляет кластерную организацию с модулями генов подсемейств DREB и Auxin, взаимосвязанными через хаб-гены. Визуализация выполнена с использованием пакета ggraph в среде R (алгоритм Фрухтермана-Рейнгольда). При строгом пороговом значении r> 0,99 в сеть вошли 57 генов, формирующих 169 функциональных связей.

При анализе взвешенных сетей ко-экспрессии генов, были выделены пять хаб-генов с максимальной связностью (degree ≥ 8) в системе. Среди них LOC126725348 (10 связей), LOC126700339 (9 связей), LOC126700341 (9 связей), LOC126705463 (8 связей) и LOC126708900 (8 связей). Наиболее высокий же показатель у гена LOC126725348 (семейства Aux/IAA), при значительной репрессии в условиях засухи. Хаб-гены DREB (LOC126700339, LOC126700341, LOC126705463, LOC126708900) характеризовались умеренной репрессией (FC = 0,19–0,40) и выступали в качестве конститутивных узлов регуляторной сети.

3.4. Функциональная характеристика хаб-генов

Центральный регуляторный ген LOC126725348 семейства Aux/IAA занимает ведущее положение в сети и показывает выраженную репрессию при засухе. При снижении его транскрипции характерно уменьшение ингибирования ARF-факторов и переключает метаболизм с ростовой программы на защитную. Хаб-гены семейства DREB (табл. 2) аннотированы в базе данных NCBI, как транскрипционные факторы типов DREB1/CBF, ERF/AP2 и DREB2A. Также их умеренная репрессия при засухе log₂FC от -1,32 до -2,39, в сочетании с высокой связностью, может указывать на роль данных транскриптов как конститутивных активаторов защитных генов.

Такая стратегия характерна для долгоживущих древесных видов. Наиболее глубокую репрессию среди них показал LOC126708900 (log₂FC = -2,39), что отражает переключение между механизмами роста и развития и адаптации к неблагоприятным факторам внешней среды, в частности засухи. Тандемная локализация генов LOC126700339 и LOC126700341 на 6-й хромосоме предполагает их совместную регуляцию в составе единого модуля.

В ходе анализа иерархической кластеризации генов методом Уорда также подтвердилось функциональное разделение двух модулей. На дендрограмме представлено (рис. 7) два основных кластера, соответствующих семействам DREB и Aux/IAA, с хаб-генами, занимающими центральные позиции в точках ветвления.

4. Обсуждение

Адаптация Q. robur к засухе является многоуровневым процессом, в котором центральное место занимает координация транскрипционных сетей для выживаемости вида. Геном Q. robur содержит 72 гена семейства DREB и 36 гена ауксинового сигналинга, что согласуется с данными о значительном расширении этих семейств у многолетних древесных растений за счёт дупликаций генома [21]. Неравномерное распределение генов по хромосомам согласуется с гипотезой о ведущей роли тандемных дупликаций в эволюции адаптивной пластичности лесных пород [22].

Анализ консервативных мотивов с помощью MEME подтвердил высокую консервативность доменов AP2/ERF и Auxin_resp. Статистическая значимость обоих мотивов крайне высока (E-value = 5,4×10⁻³⁸⁶ для AP2/ERF и 8,6×10⁻²¹² для Auxin_resp), что позволяет судить о правильной идентификации генов в транскриптоме и способности данных факторов точно распознавать регуляторные последовательности ДНК.

Взвешенная сеть ко-экспрессии составила 57 ключевых генов, образующие между собой 169 функциональных связей с чётким разделением на DREB-зависимый и ауксин-зависимый модули. Подробный анализ дифференциальной экспрессии (FDR < 0,08) показал значительную репрессию генов ауксинового сигналинга, при повышении экспрессии у DREB-зависимых генов. Рассмотрение межмолекулярных связей между хаб-генами DREB и Aux/IAA в сети ко-экспрессии подтверждает механизм скоординированной регуляции стрессовых и ростовых программ, описанный ранее в литературных источниках для долгоживущих древесных видов. Данный механизм обеспечивает оптимизацию энергетического баланса при водном дефиците [23].

Центральное место в сети ко-экспрессии занимает хаб-ген LOC126725348 семейства Aux/IAA, расположенный на хромосоме 3. Он обладает максимальной связностью (10 рёбер) и сильно репрессирован при засухе (log₂FC = –1,78; FC = 0,29). Снижение его транскрипции нарушает ауксиновый гомеостаз, тормозит вегетативный рост и перераспределяет ресурсы в пользу защитных механизмов [24], [25]. Высокая степень связанности данной системы напрямую устанавливает устойчивость всей системы [26]. Гены DREB, локализованные на 6-й хромосоме (LOC126700339 и LOC126700341), сохраняют статус хабов даже при умеренной репрессии. Умеренная репрессия DREB-хабов на фоне их высокой базальной экспрессии при поливе согласуется с экономией ресурсов в условиях стресса, так как транскрипционный аппарат поддерживает уже накопленный пул регуляторов. Кроме того, в ранее проведенных нами исследованиях по изучению транскрипционной активности DREB2А у Q. robur с помощью ОТ-ПЦР-РВ было установлено, что данный ген интенсивно экспрессируется в начале засухи, а к поздним срокам эксперимента наблюдается снижение его активности [27]. Высокая конститутивная активность данных генов обеспечивает формирование состояния предадаптации, благодаря которому транскрипционный аппарат Q. robur готовность к длительным неблагоприятным условиям среды, за счет базальной экспрессии защитных генов [17].

Настоящее исследование имеет ограничение вследствие отсутствия биологических повторностей, что не позволяет оценить внутригрупповую дисперсию и уменьшает статистическую точность анализа дифференциальной экспрессии. Полученные значения log₂FC и точная структура сети ко-экспрессии требуют валидации методом ПЦР в реальном времени на независимой выборке растений.

5. Заключение

В ходе полногеномного анализа транскриптома Q. robur были идентифицированы 72 гена семейства DREB и 36 генов семейства Aux/IAA, подтвержденные наличием в них высококонсервативных структурных доменов AP2/ERF и Auxin_resp. Структурный и транскриптомный анализ показал, что расширение этих семейств обусловлено тандемными дупликациями и чёткой кластеризацией генов на 1-й, 4-й, 8-й и 9-й хромосомах. В качестве центрального элемента регуляторной сети идентифицирован хаб-ген LOC126725348 (Aux/IAA), локализованный на хромосоме 3. Его репрессия (log 2FC = –1,78) инициирует замедление вегетативного роста, перераспределяя энергетический ресурс в пользу защитных механизмов. Координированное взаимодействие этого узла с хаб-генами DREB на 6-й хромосоме (LOC126700339, LOC126700341) обеспечивает состояние преадаптации. Характерное для многолетних растений с целью снижения энергетических затрат. Построение сети ко-экспрессии с использованием попарных коэффициентов корреляции Пирсона позволило выявить ключевые хаб-гены, среди которых LOC126725348, LOC126710403, LOC126700339, LOC126700341, LOC126705463 и LOC126708900. Наиболее перспективными кандидатами на роль молекулярных маркеров для селекции засухоустойчивых генотипов Q. robur могут служить гены LOC126700339, LOC126700341 и стресс-индуцируемый ген LOC126717446.

The additional file for this article can be found as follows: