Сравнительный анализ DUF1471-содержащих белков Serratia marcescens SM6
Сравнительный анализ DUF1471-содержащих белков Serratia marcescens SM6
Аннотация
Бактерии используют разнообразные механизмы для адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды. Одним из таких малоизученных механизмов является секреция внеклеточных метаболитов, пептидов и белков. Белки, содержащие домен DUF1471, часто синтезируются в условиях стресса, но об их роли в физиологии бактерий известно очень мало. Большинство исследований, посвящённых белкам с DUF1471 доменом проводились на Salmonella Typhimurium и Escherichia coli. У Serratia marcescens такие белки практически не изучались. В этой работе мы провели биоинформатический анализ белков, содержащих DUF1471 домен, сравнив их с аналогичными белками у трех близкородственных видов из порядка Enterobacterales: Salmonella Typhimurium, Escherichia coli и Yersinia pestis. Проведенный анализ позволил дать белкам S. marcescens названия и предположить их роль в физиологии бактерии, тем самым расширив наши знания о белках, содержащих DUF1471 домен и дополнительных методах борьбы с патогенными микроорганизмами.
1. Введение
Одним из бактериальных клеточных компонентов, перспективных для изучения в связи с их консервативным статусом, широким распространением среди бактерий, а также до конца не изученной функцией, представляются белки, содержащие DUF-домены (Domains of unknown function). Установление функций белков с неизвестными доменами крайне важно для того, чтобы охарактеризовать все компоненты живых систем. Семейство низкомолекулярных секретируемых белков с консервативным доменом неизвестной функции DUF1471 было обнаружено более двадцати лет назад . Однако небольшое количество аминокислот в их составе затрудняет их обнаружение и последующий анализ по сравнению с более крупными белками. В настоящее время семейство DUF1471 включает несколько сотен белков, все из которых обнаружены у бактерий порядка Enterobacterales. Многие из этих видов бактерий содержат в своем геноме несколько генов, кодирующих паралоги белков с доменом DUF1471 . Белки с доменом DUF1471 часто активируются в ответ на неблагоприятные условия среды. Кроме того, отдельные исследования позволили установить роль этих белков в колонизации биотических и абиотических поверхностей , , , . Однако на текущий момент понимание функций, выполняемых белками с DUF1471 доменом, весьма ограничено. Serratia marcescens – оппортунистический патоген из порядка Enterobacterales, который вызывает заболевания центральной нервной системы, инфекции мочевыводящих путей, пневмонию и другие респираторные заболевания, инфекции кровотока, и многие другие типы раневых инфекций . S. marcescens обладает природной устойчивостью к ряду антибиотиков, включая полимиксины, в связи с чем необходимо найти альтернативные способы борьбы с этой бактерией, не зависящие от применения антибиотиков . Одним из таких способов может быть воздействие на дополнительные мишени для ингибирования роста бактерии, а белки, содержащие домен DUF1471, могут быть одной из таких мишеней.
2. Методы и принципы исследования
Для анализа репертуара белков с DUF1471 доменом использовали геномные последовательности S. Typhimurium LT2 , Y. pestis KIM , E. coli K-12 , S. marcescens SM6 , доступные в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номерами AE006468.2, AE009952.1, NC_000913.3 и NZ_SDUW00000000.1, соответственно. Поиск функций, связанных с каждым из идентифицированных белков, проводили по названию локусов в базе данных PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). Для определения предположительной функции белков с DUF1471 доменом у S. marcescens провели анализ гомологии DUF1471-содержаших белков S. marcescens с использованием программного обеспечения BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
3. Основные результаты
Анализ геномных последовательностей показал, что несмотря на то, что белки с DUF1471 доменов присутствуют в каждом виде бактерий, их количество сильно варьирует. Так, геном S. marcescens SM6 содержит 14 генов, кодирующих белки, содержащие домен DUF1471. У Salmonella Typhimurium LT2 таких белков 11, у Yersinia pestis KIM – пять, а у Escherichia Coli K-12 – десять (Таблица 1).
Таблица 1 - Белки с доменом DUF1471 грамотрицательных бактерий порядка Enterobacterales
Организм | Локус | Белок | Размер, а.о. | Известная функция | Ссылки на работы |
Salmonella Typhimurium LT2 | STM0082 | SrfN | 96 | Необходим для вирулентности
| , , |
STM0366 | YahO | 91 | Необходим для вирулентности. Экспрессия повышается в средах с низким рН | , | |
STM0565 | STM0565 | 78 | Экспрессия понижается в средах с добавлением перекиси водорода | ||
STM0823 | YbiJ | 86 | Активируется в присутствии DHMA (3,4-дигидроксиминдальной кислоты). Может участвовать в приобретении железа |
| |
STM1214 | YcfR | 85 | Известен как белок множественной устойчивости к стрессу. Делеция ycfR вызывает структурные изменения липополисахаридов и дестабилизирует целостность оболочки. Мутант, лишенный гена ycfR также имеет сниженную подвижность и его вирулентность снижается. Необходим для образования биопленок | , , , , | |
STM1478 | SssB/YdgH | 314 | Участвует в патогенезе. У мутанта с делецией гена ydgH/sssB значительно ослабляется вирулентность у мышей | ||
STM3361 | YhcN | 87 | Активируется при стрессе, индуцированным хлором | ||
STM3362 | STM3362 | 88 | Функция неизвестна |
| |
STM4378 | YjfN | 106 | Функция неизвестна |
| |
STM4379 | BsmA | 109 | Функция неизвестна |
| |
STM4389 | YjfY | 91 | Функция неизвестна |
| |
Yersinia pestis KIM | y3909 | AAM87453.1 | 92 | Транскрипция гена y3909 значительно увеличивается при кислом pH 4,5, но делеция y3909 не снижает толерантность к кислоте | |
y1667 | AAM85236.1 | 86 | Экспрессия y1667 увеличивается при заражении блох. Делеция гена снижает способность формировать биопленки при пониженных значениях pH среды | ||
y0640 | AAM84228.1 | 53 | Функция неизвестна |
| |
y2136 | AAM85698.1 | 317 | Функция неизвестна |
| |
y0666 | AAM84254.1 | 87 | Необходим для адаптации к стрессу, вызванному низким pH среды. Транскрипция y0666 значительно увеличивается с повышением кислотности среды | ||
Escherichia coli K-12 | b4199 | YjfY | 91 | Повышенно экспрессируется при формировании биопленок в моче человека | |
b0329 | YahO | 91 | Делеция гена yahO увеличивает чувствительность к рентгеновскому и ультрафиолетовому излучению. Может быть вовлечен в устойчивость к высоким значениям pH среды | , | |
b0806 | McbA (YbiM) | 86 | Экспрессия McbA репрессируется McbR. Удаление McbR делает возможной экспрессию, что приводит к перепроизводству колановой кислоты, вызывая мукоидию, что предотвращает образование биопленок | ||
b4189 | BsmA (YjfO) | 109 | Влияет на образование биопленок в ответ на стресс | ||
b0802 | YbiJ | 86 | У мутантов с удаленным геном YbiJ существенно снижается способность формировать биопленки в человеческой моче. Снижается подвижность на чашках с агаром, содержащим мочу | ||
b0303 | RclB | 78 | Необходим для выживания в условиях стресса, вызванного хлором в среде | ||
b3238 | YhcN | 87 | Связан с реакцией на окислительный и кислотный стресс и с образованием биопленок | ||
b1112 | BhsA (YcfR) | 85 | Необходим для колонизации поверхности листьев салата и формирования биопленок. Индуцируется воздействием перекиси водорода и во время роста биопленок и при воздействии различных факторов стресса, включая кадмий, медь и тепловой шок | , , | |
b4188 | YjfN | 91 | Положительно регулируется в ответ на стресс и является активатором DegP, консервативной протеазы, служащей для удаления неправильно уложенных белков в периплазме. Суперэкспрессия YjfN повышает жизнеспособность клеток при стрессе, вызванном неправильно уложенными белками | ||
b1604 | YdgH | 314 | Функция неизвестна |
| |
Serratia marcescens SM6 | EG355_00520 | TBU70968 | 87 | Функция неизвестна |
|
EG355_00525 | TBU70861 | 87 | Функция неизвестна |
| |
EG355_00635 | TBU70881 | 88 | Функция неизвестна |
| |
EG355_00650 | TBU70884 | 102 | Функция неизвестна |
| |
EG355_00655 | TBU70885 | 91 | Функция неизвестна |
| |
EG355_05865 | TBU70217 | 86 | Функция неизвестна |
| |
EG355_06280 | TBU70295 | 85 | Функция неизвестна |
| |
EG355_06285 | TBU70296 | 85 | Функция неизвестна |
| |
EG355_06285 | TBU68018 | 316 | Функция неизвестна |
| |
EG355_08300 | TBU70671 | 94 | Функция неизвестна |
| |
EG355_09650 | SrfN (TBU68088) | 86 | Необходим для выживания бактерии в условиях кислотного и оксидативного стрессов | ||
EG355_19345 | TBU67220 | 94 | Функция неизвестна |
| |
EG355_21810 | TBU66869 | 86 | Функция неизвестна |
|
Проведенный анализ показал, что 13 из 14 белков S. marcescens имеют гомологов у S. Typhimutium LT2, все 14 – у E. coli K-12, а 6 – у Y. pestis KIM (Таблица 2).
Таблица 2 - Сравнение белков S. marcescens, содержащих DUF1471 домен с белками Salmonella Typhimutium LT2, Escherichia coli K-12 MG1655 и Yersinia pestis KIM10+
Локус | Белок | Размер, а.о. | Степень гомологии известными DUF1471-содержащими белками | Предлагаемое название | ||
Salmonella Typhimutium LT2 | Escherichia сoli K-12 MG1655 | Yersinia pestis KIM10+ | ||||
EG355_00520 | TBU70968 | 87 | 56% идентичности, 74% сходства к белку YhcN (STM3361); 49% идентичности, 68% сходства к белку STM3362; 45% идентичности, 57% сходства к белку SrfN (STM0082); 30% идентичности, 48% сходства к белку YahO (STM0366) | 61% идентичности, 79% сходства к белку YhcN (b3238); 41% идентичности, 63% сходства к белку YjfY (b4199); 36% идентичности, 56% сходства к белку McbA (b0806)
| 38% идентичности, 56% сходства к белку AAM87453.1 (y3909) | YhcN |
EG355_00525 | TBU70861 | 87 | 53% идентичности, 75% сходства к белку YhcN (STM3361); 49% идентичности, 68% сходства к белку STM3362; 42% идентичности, 59% сходства к белку SrfN (STM0082); 35% идентичности, 54% сходства к белку YahO (STM0366); 36% идентичности, 54% сходства к белку YdgH (STM1478) | 54% идентичности, 77% сходства к белку YhcN (b3238); 42% идентичности, 61% сходства к белку YjfY (b4199) | 36% идентичности, 59% сходства к белку AAM87453.1 (y3909) | YhcN_2 |
EG355_00635 | TBU70881 | 88 | 32% идентичности, 57% сходства к белку YhcN (STM3361) | 31% идентичности, 56% сходства к белку YhcN (b3238); 34% идентичности, 52% сходства к белку YjfN (b4188) | Значительной гомологии не обнаружено | YhcN_3 |
EG355_00650 | TBU70884 | 102 | 57% идентичности, 67% сходства к белку BsmA (STM4379); 39% идентичности, 44% сходства к белку YjfN (STM4378) | 57% идентичности, 69% сходства к белку BsmA (b4189); 37% идентичности, 48% сходства к белку YjfN (b4188) | 62% идентичности, 81% сходства к белку AAM84228.1 (y0640); 36% идентичности, 54% сходства к белку AAM87453.1 (y3909) | BsmA |
EG355_00655 | TBU70885 | 91 | 54% идентичности, 70% сходства к белку YjfN (STM4378) | 48% идентичности, 60% сходства к белку YjfN (b4188) | Значительной гомологии не обнаружено | YjfN |
EG355_05865 | TBU70217 | 86 | 52% идентичности, 65% сходства к белку BhsA (STM1214); 58% идентичности, 66% сходства к белку YbiJ (STM0823) | 51% идентичности, 65% сходства к белку BhsA (b1112) | Значительной гомологии не обнаружено | BhsA_2 |
EG355_06280 | TBU70295 | 85 | 54% идентичности, 65% сходства к белку BhsA (STM1214); 36% идентичности, 64% сходства к белку YhcN (STM3361); 28% идентичности, 48% сходства к белку YahO (STM0366) | 55% идентичности, 68% сходства к белку BhsA (b1112); 29% идентичности, 50% сходства к белку YahO (b0329) | 29% идентичности, 52% сходства к белку AAM87453.1 (y3909) | BhsA_3 |
EG355_06285 | TBU70296 | 85 | 55% идентичности, 70% сходства к белку BhsA (STM1214); 53% идентичности, 72% сходства к белку YbiJ (STM0823) | 54% идентичности, 69% сходства к белку BhsA (b1112) | Значительной гомологии не обнаружено | BhsA |
EG355_06285 | TBU68018 | 316 | 70% идентичности, 83% сходства к белку YdgH (STM1478); 28% идентичности, 59% сходства к белку YhcN (STM3361); 29% идентичности, 52% сходства к белку STM3362 | 70% идентичности, 83% сходства к белку YdgH (b1604) | Значительной гомологии не обнаружено | YdgH |
EG355_08300 | TBU70671 | 94 | 43% идентичности, 57% сходства к белку YjfN (STM4378); 29% идентичности, 59% сходства к белку YdgH (STM1478) | 36% идентичности, 47% сходства к белку YjfN (b4188); 35% идентичности, 60% сходства к белку YjfY (b4199) | 35% идентичности, 51% сходства к белку AAM84228.1 (y0640) | YjfN_2 |
EG355_09650 | TBU68088 | 86 | 60% идентичности, 70% сходства к белку YbiJ (STM0823); 38% идентичности, 54% сходства к белку YhcN (STM3361) | 57% идентичности, 68% сходства к белку YbiJ (b0802) | Значительной гомологии не обнаружено | YbiJ |
EG355_19345 | TBU67220 | 94 | 47% идентичности, 68% сходства к белку SrfN (STM0082); 42% идентичности, 62% сходства к белку YahO (STM0366); 38% идентичности, 54% сходства к белку YhcN (STM3361); 31% идентичности, 55% сходства к белку STM3362 | 39% идентичности, 61% сходства к белку YahO (b0329); 38% идентичности, 54% сходства к белку YhcN (b3238) | 60% идентичности, 74% сходства к белку AAM87453.1 (y3909) | SrfN |
EG355_21810 | TBU66869 | 86 | 45% идентичности, 62% сходства к белку BhsA (STM1214); 48% идентичности, 63% сходства к белку YbiJ (STM0823) | 45% идентичности, 62% сходства к белку BhsA (b1112); 38% идентичности, 56% сходства к белку McbA (b0806); 48% идентичности, 63% сходства к белку YbiJ (b0802); 34% идентичности, 51% сходства к белку YhcN (b3238) | Значительной гомологии не обнаружено | YbiJ_2 |
EG355_21825 | TBU66872 | 70 | Значительной гомологии не обнаружено | 36% идентичности, 52% сходства к белку YhcN (b3238) | Значительной гомологии не обнаружено |
|
В каждом виде бактерий есть белок гораздо большего размера, чем все остальные (STM1478 (SssB/YdgH) у S. Typhimurium, y2136 у Y. pestis, b1604 (YdgH) у E. coli и TBU68018 у S. marcescens. В нем содержатся целых три DUF1471 домена. У S. marcescens TBU68018 имеет размер 316 а.о., а домены располагаются от 34 до 89 а.о.; от 119 до 174 а.о.; от 260 до 315 а.о. Он имеет высокую и одинаковую степень гомологичности белкам STM1478 и b1604 у S. Typhimurium и E. coli, соответственно. Эти белки имеют общее название YdgH. YdgH S. Typhimurium участвует в патогенезе. Мутант, в котором ген ydgH/sssB инактивирован, значительно ослаблен в отношении вирулентности у мышей через один день после заражения . Кроме того, удаление гена ydgH в Serratia marcescens повышает восприимчивость бактерии к антибиотику цефокситину, а мутанты, лишенные гена ydgH, обладают уменьшенной восприимчивостью к нескольким цефалоспоринам третьего поколения, и, напротив, повышенной восприимчивостью к катионным и анионным детергентам .
Белок TBU70968 наиболее приближен к белкам YhcN у E. coli (b3238) и S. Typhimurium (STM3361). У всех трех белков DUF1471 домен смещен от N-конца приблизительно на 30 аминокислотных остатков и занимает около 50 а.о. Белок YhcN активируется у S. Typhimurium при стрессе, индуцированным хлором, а у E. coli YhcN связан с реакцией на окислительный и кислотный стресс и с образованием биопленок , . Кроме того, белки TBU70861, TBU70881 также наибольший процент гомологии имеют к белкам YhcN, но при этом меньший, чем у TBU70968, в связи с чем мы дали им названия YhcN_2 и YhcN_3. Предположительно, они являются паралогами YhcN в геноме S. marcescens. Примечательно, что, хотя S. marcescens относится к семейству Yersiniaceae, белки с доменом DUF1471 S. marcescens и Y. pestis имеют наименьший процент идентичности, за исключением двух, а именно: TBU70884 (S. marcescens) и AAM84228.1 (y0640); TBU67220 (S. marcescens) и AAM87453.1 (y3909). Вероятно, это связано с распространением белков с DUF1471 доменом у Y. pestis, где их значительно меньше, а также с образом жизни S. marcescens, Salmonella и E. coli, которые, в отличие от Y. pestis могут колонизировать разнообразные поверхности.
TBU70884 имеет наибольший процент идентичности с белком Y. pestis y0640, хотя размер белков отличается на 49 аминокислотных остатков: 102 а.о. и 53 а.о., соответственно. Гомология в данном случае основывается исключительно на DUF1471 домене, который составляет практически весь размер белка y0640 у Y. pestis (52 а.о.) и 54 а.о. из 102 а.о. у S. marcescens. О роли белка y0640 в физиологии Y. pestis ничего неизвестно кроме того, что он относится к семейству белков YhcN . Кроме того, TBU70884 на 57% идентичен белку E. coli BsmA. У E. coli этот белок влияет на образование биопленок в ответ на стресс .
Два белка у S. marcescens (TBU70885 и TBU70671) оказались наиболее гомологичны белку S. Typhimurium YjfN (STM4378) и получили названия YjfN и YjfN_2, соответственно, на основании степени идентичности. Все три белка имеют DUF1471 домен размером в 55 а.о., примыкающий к C-концу. У E. coli YjfN положительно регулируется в ответ на стресс и является активатором DegP, консервативной протеазы, служащей для удаления неправильно уложенных белков в периплазме. Суперэкспрессия YjfN повышает жизнеспособность клеток при стрессе, вызванном неправильно уложенными белками .
Три белка S. marcescens имеют наибольший процент идентичности с белком BhsA (TBU70296, TBU70217 и TBU70295), причем как к этому белку у Salmonella, так и у E. coli. TBU70295, TBU70296, STM1214 (BhsA) и b1112 (BhsA) имеют одинаковый размер в 85 а.о. и одинаковое расположение домена (с 33 по 84 а.о.). TBU70217 отличается от них по размеру, и по расположению (сдвиг к C-концу) на 1 а.о. Они получили названия BhsA, BhsA_2 и BhsA_3, соответственно. У E.coli было показано, что ген bhsA, вместе с еще одним геном - ybiM (mcbA), необходимы для колонизации поверхности листьев салата и формирования биопленок . Как bhsA, так и yhcN индуцируются воздействием перекиси водорода на E. coli K-12 . Кроме того, экспрессия bhsA индуцируется во время роста биопленок и при воздействии различных факторов стресса, включая кадмий, медь и тепловой шок , . Кроме того, у мутантов E. coli K-12, лишенных bhsA или yhcN, изменяется процесс формирования биопленок, и они более чувствительны к перекиси водорода и кадмию , , что позволяет предположить, что эти белки могут играть роль в общей реакции на стресс. У энтерогеморрагического штамма E. coli ген bhsA, вместе с yhcN повышенно регулировались при выращивании штамма в среде, содержащей метаболиты микробиоты кишечника человека, таким образом отвечая на оксидативный стресс .
Белки TBU68088 и TBU66869 получили названия YbiJ и YbiJ_2, соответственно. Все они, кроме TBU66869, одного размера и с одинаковым расположением домена. Домен TBU66869 занимает на 7 а.о. больше. У E. coli YbiJ, вместе с белками YhaK и YhcN, играет роль в образовании биопленок и подвижности бактерии. У мутантов с удаленным геном ybiJ существенно снижается способность формировать биопленки в человеческой моче и подвижность на чашках с агаром, содержащим мочу .
Гомолог белка TBU67220 (SrfN) у S. Typhimurium принимает участие в патогенезе, а его делеция ослабляет способность бактерии заражать мышей , . SrfN Serratia marcescens SM6 необходим для выживания бактерии в условиях кислотного и оксидативного стрессов .
Особый интерес представляет белок TBU66872. В нем содержится 2 домена: от 1 до 28 а.о. и от 46 до 70 а.о., и аналогов ему, кроме YhcN (b3238) у E. coli, у близкородственных организмов не нашлось. Степень же идентичности b3238 недостаточно высока, чтобы однозначно дать этому белку наименование.
4. Заключение
Таким образом, проведенный нами анализ позволил соотнести белки с DUF1471 доменом S. marcescens SM6 с наиболее изученными аналогичными белками у трех близкородственных видов Salmonella Typhimutium LT2, Escherichia coli K-12 MG1655 и Yersinia pestis KIM10+ и дал возможность предположить их возможную функцию.