INFLUENCE OF FULLERENE DERIVATIVES WITH A SINGLE MINOR SUBSTITUTION IN THIOPHENE ADDENDUM ON THE EXPRESSION LEVEL OF NADPH-OXIDASE 4 IN HUMAN EMBRYONIC LUNG FIBROBLASTS
INFLUENCE OF FULLERENE DERIVATIVES WITH A SINGLE MINOR SUBSTITUTION IN THIOPHENE ADDENDUM ON THE EXPRESSION LEVEL OF NADPH-OXIDASE 4 IN HUMAN EMBRYONIC LUNG FIBROBLASTS
Abstract
The search for highly effective antioxidants is an urgent biomedical task. Fullerenes and their derivatives have high antioxidant activity, which makes them potential drugs for the treatment of diseases caused by reactive oxygen species. The aim of this work was to study the effect of minor substitution (methyl radical to carboxymethyl radical) in one of the addenda of water-soluble fullerene C60 derivatives with the general formula C60Ar5Th'Th‘’H on the level of reactive oxygen species in human embryonic lung fibroblast cells at different concentrations and time intervals. It is shown that the fullerene derivative C60, which does not have a carboxyl group as a minor substitution, has a longer (24 hours) antioxidant effect. The obtained data indicate a high antioxidant potential of this compound, which makes it a promising object for further research.
1. Введение
Производные фуллеренов стали предметом интенсивных исследований в последние десятилетия. Фуллерены проявляют широкий спектр различной биологической активности и могут применяться в качестве вектора для доставки лекарств, противораковых , , , , антивирусных , , , , антибактериальных препаратов , , а также для таргетной доставки веществ , , что делает их перспективными кандидатами, как для диагностики, так и для терапевтического применения. Благодаря наличию большого количества двойных сопряжённых связей фуллерены и их водорастворимые производные являются мощными акцепторами свободных радикалов, что делает этот класс соединений привлекательным инструментом для регулирования свободнорадикальных процессов и для снижения тяжести окислительного стресса в биологических системах , , , . Благодаря их высокой антиоксидантной активности водорастворимые производные могут применяться для лечения заболеваний, вызванных активными формами кислорода , , . Данное свойство делает эти наносоединения предметом интереса не только генетики и молекулярной биологии, но также и биофизики.
2. Методы и принципы исследования
2.1. Клеточные культуры
Клеточная культура эмбриональных фибробластов легкого человека (ФЛЭЧ) 4-го пассажа для данного исследования была предоставлена ФГБНУ «МГНЦ». Культивирование проводилось при температуре 37°C в среде DMEM (ПанЭко, Россия), обогащенной 20%-ной телячьей сывороткой (PAA Laboratories, Вена, Австрия). В среду добавляли 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10 мг/мл гентамицина (данные реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) . Клетки ФЛЭЧ инкубировали с водными растворами фуллеренов в CO2 инкубаторе при температуре 37°C в атмосфере 5%, в течение 1, 3 и 24 часов.
2.2. Производные фуллерена С60
![Химические формулы исследованных водорастворимых производных фуллеренов С60](/media/images/2024-09-24/a196712f-1c01-4fb7-ad51-661d13de8d2d.jpg)
Рисунок 1 - Химические формулы исследованных водорастворимых производных фуллеренов С60
Токсичность соединений определяли методом метилтетразолиевым теста (МТТ-тест). В основе данного метода лежит реакция восстановления желтого МТТ (метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромида) до пурпурного формазана с помощью дегидрогеназ митохондрий. Реакция протекает только в жизнеспособных клетках с функционирующими ферментами митохондрий. Измерение флуоресценции окрашенных клеток осуществлялось на приборе EnSpire Equipment (EnSpire Equipment, Турку, Финляндия), длина волны возбуждения составляла 𝜆ex = 488 нм, длина волны испускания 𝜆em = 528 нм. Эксперименты проведены не менее чем в восьми повторах.
2.4. Определение количества АФК
Уровень синтеза АФК в культуре клеток измеряли с помощью H2DCFH-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетата), данный краситель способен быстро проникать через клеточные мембраны, и гидролизоваться до DCFH в цитозоле гидролазами клетки. DCFH не флуоресцирует в клетках, но является чувствительным маркером окислительного стресса. При взаимодействии DCFH и АФК, данный краситель окисляется до флуоресцирующего DCF. Уровень синтеза АФК измерялся на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (Beckman Coulter). По окончании времени воздействия фуллерена на клетки добавлялся раствор H2DCFH-DA и проводился анализ изменения флуоресценции сигнала в зависимости от времени инкубации клеток в присутствии красителя. Скорость синтеза DCF отражает количество АФК в клеточной культуре.
2.5. Определение уровня экспрессии белка
Экспрессию белка оценивали методом проточной цитометрии с использованием специфических антител (CY5.5-NOX4 (bs-1091r-cy5-5, антитела Bioss, Inc. Воберн, Массачусетс, США) на проточном цитофлуориметре CyFlow Space (Partec, Meckenheim, Германия).
2.6. Оценка уровня мРНК
Оценка экспрессии генов производилась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Выделение РНК после воздействия фуллеренов на клетки осуществлялось по стандартной методике набора YellowSolve (Клоноген, Санкт-Петербург, Россия). Измерение концентрации РНК проводилось на планшетном ридере (EnSpire, Турку, Финляндия), λ ex = 487 нм, λ fl = 524 нм. Для проведения реакции обратной транскрипции по стандартной методике использовали реагенты фирмы Sileks (Москва, Россия). ПЦР проводили с использованием соответствующих праймеров (Synthol) и смеси SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Калифорния, США) на приборе StepOnePlus (Applied Biosystems, Калифорния, США). Погрешность составила около 2%. В качестве гена референса использовался TBP .
3. Основные результаты
Исследовали влияние водорастворимых производных фуллеренов F-167 и F-99. Для оценки цитотоксичности исследуемых соединений в отношении нормальных клеток человека – ФЛЭЧ – был проведён МТТ-тест (рисунок 2). Фуллерены добавлялись в среду в начале культивирования ФЛЭЧ. Длительность культивирования составляла 72 часа.
![Выживаемость клеток линии ФЛЭЧ в присутствии фуллеренов по результатам МТТ-теста: А – F-167; Б – F-99](/media/images/2024-10-23/a5734434-7e3e-43cc-82d0-cdd96c45ac18.png)
Рисунок 2 - Выживаемость клеток линии ФЛЭЧ в присутствии фуллеренов по результатам МТТ-теста:
А – F-167; Б – F-99
Примечание: данные МТТ теста представлены в виде среднего значения, вертикальные линии указывают на максимальное и минимальное значения выживаемости для определенной концентрации фуллерена; по оси Х – концентрации фуллеренов, обозначены на рисунке; по оси Y – оптическая плотность при 570 нм; зеленая линия – контроль, по оси ординат отложены значения МТТ-теста относительно контрольного образца (клетки, культивируемые без производных фуллерена)
![Зависимость уровня синтеза DCF в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени](/media/images/2024-10-23/dc5ed1b2-dfaa-4ebe-a13a-aa7cdf482260.png)
Рисунок 3 - Зависимость уровня синтеза DCF в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени
Примечание: 1, 3, 24 часа инкубации
![Уровень белка NOX4 в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени](/media/images/2024-10-23/7b8beb60-2f9d-4495-9158-0aad15ca9cac.png)
Рисунок 4 - Уровень белка NOX4 в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени
Примечание: 1, 3, 24 часа инкубации; * – достоверные отличия с контрольными клетками, p <0,01, непараметрический U-тест
![Уровень экспрессии гена NOX4 в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени](/media/images/2024-10-23/9733698f-3ae8-44cd-9deb-813814e7bb02.png)
Рисунок 5 - Уровень экспрессии гена NOX4 в клетках ФЛЭЧ при инкубации с фуллеренами F-167 и F-99 в концентрации 18 нг/мл (А) и 28 мкг/мл (Б) и к контролю от времени
Примечание: 1, 3, 24 часа инкубации; * – достоверные отличия с контрольными клетками, p <0,01, непараметрический U-тест
4. Обсуждение
Вероятно, при добавлении производных фуллеренов F-99 и F-167 к клеткам ФЛЭЧ в среду культивирования, данные соединения работают как акцепторы свободных радикалов на протяжении 3 часов, что можно отследить по уровню АФК. Однако уровень экспрессии NOX4 различается для этих соединений, как на уровне белка, так и на уровне гена в интервале 1-24 часа. Уровень транскрипционной активности NOX4 выше для F-99, чем для F-167 от 1 до 24 часов, а следовательно ферментный комплекс не только успевает синтезироваться в достаточном количестве, но и начинает активно функционировать, в связи с резким падением уровня АФК, что объясняет высокий уровень АФК после 24 часов при воздействии F-99.
5. Заключение
Исследованные водорастворимые производные фуллерена С60 с одной минорной заменой (метильного радикала на карбоксиметильный) активно участвуют в гомеостазе АФК в клетках ФЛЭЧ. Был изучен большой диапазон концентраций и выбраны две для каждого соединения – 18 нг/мл (концентрация, входящая в диапазон нетоксичных концентраций фуллеренов); и концентрация, близкая к повреждающей – 28 мкг/мл. При добавлении в среду культивирования клеток ФЛЭЧ in vitro соединения показали себя как эффективные антиоксиданты в первые 3 часа инкубации, наиболее эффективным антиоксидантом оказалось производное фуллерена F-167 в концентрации 18 нг/мл. Наблюдалось повышение уровня АФК через 24 часа культивирования ФЛЭЧ в присутствии исследуемого соединения F-99 связано с усилением транскрипционной активности гена NOX4, приводящей к увеличению экспрессии белка NOX4. Таким образом, данное исследование открывает новые перспективы использования фуллеренов и их производных и дает предпосылки к дальнейшему подробному изучению влияния на клетки человека.